Лекция Промышленное производство бактериофагов

Бактериофаги или фаги (от латинского bakteriophage – разрушающий бактерии) – вирусы, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их лизис. Однако выделен такой литический агент был лишь в 1917 г. д'Эреллем. Это был бактериофаг, специфичный для палочки дизентерии Григорьева-Шига. В х годах бактериофаги заняли заслуженное место среди других лечебно- профилактических препаратов. Феномен бактериофагии впервые наблюдал в 1898 г. Н.Ф.Гамалея. Он установил, что густая взвесь сибиреязвенных микроорганизмов в дистиллированной воде в известных условиях может просветляться. Просветленная вода приобретала способность растворять свежую культуру сибиреязвенных микроорганизмов.

Фаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновых кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с микробной клеткой. Бактериофаги специфичны для различных видов бактерий. По степени специфичности фаги могут быть разделены на три группы: полифаги – активные в отношении нескольких родственных видов, монофаги – лизирующие микроорганизмов одного типа, типовые фаги, способные лизировать только определенные типы данного вида.

Классификация бактериофагов В настоящее время еще не разработано единой классификации вирусов вообще и бактериофагов в частности. Практическая необходимость привела к появлению классификаций, в основу которых положены общая морфология частицы (морфотип) и свойства генетического материала. Международный комитет по таксономии вирусов предлагает при классификации использовать свойства вириона и его нуклеиновой кислоты: морфологию и размеры вириона; молекулярную масса частицы, седиментационные свойства, ее плавучую плотность;

тип, молекулярную массу, относительную долю, конформацию и состав нуклеиновой кислоты; данные о гибридизации нуклеиновой кислоты; физиологические тесты и тесты на спектр литической активности.

Структура и морфология фагов Бактериофаги принадлежат к числу наиболее хорошо известных вирусов. Современные представления о морфологии фагов связаны с изучением их методом электронной микроскопии. Морфология бактериофагов исследовалась преимущественно на Т-фагах Escherichia coli. По форме они сходны со сперматозоидом.

Фаг Т-2 состоит из головки длиной 100 нм и отростка или «хвоста» примерно такой же длины. Головка фага напоминает форму шестиугольника, диаметром от 60 до 90 нм, довольно фригидна и состоит из белковой оболочки (построенной из отдельных субъединиц) и заложенного в ней генетического материала – ДНК. Количество белка и ДНК примерно одинаково.

В нем можно различить не менее трех частей: полый стержень, окружающий его сократительный чехол и находящуюся на дистальном конце стержня шестиугольной формы базальную пластинку с шестью шипами и шестью нитями (фибриллы). Отросток фага Т-2 имеет особенно сложное строение.

От шипов и нитей зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине. Длина хвостового отростка до 250 нм, ширина 20 – 25 нм. Хвостовой отросток предназначен для прикрепления фага к бактериальной клетке. На электронных микрофотографиях препаратов фагов можно видеть фаговые частицы в двух состояниях: у одних частиц головка очень редко выделяется на общем фоне и чехол отростка растянут, у других головка мало отличается от фона по своей электронной плотности и чехол сжат (сократился). Первое состояние характерно для активного фага, в головке которого заключено ДНК, второе для фага, который инъецировал свою ДНК в бактериальную клетку.

Химический состав Фаги состоят из белка, на долю которого приходится 50 – 60 %, нуклеиновой кислоты – 40 – 50% и небольшого количества липидов в виде нейтральных жиров (1,7 – 2,6%). Большинство фагов содержит двухцепочечную ДНК, однако обнаружено много фагов с одноцепочечной ДНК или РНК. ДНК фага имеет спиралеобразное строение, характеризуется высокой полярностью и отличается от ДНК бактерий своим нуклеотидным составом. Молекулы ДНК бактериофага Т4

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой Фаг действует на живые клетки бактерий в процессе их активного роста и не действует на мертвых микроорганизмов. Крайним выражением процесса бактериофагии является лизис бактерий. Наряду с этим при взаимодействии фага и бактерии можно наблюдать самые различные изменения бактерий – от едва заметных морфологических до полного растворения и их гибели. Следовательно, под бактериофагией в широком смысле слова надо понимать не только лизис бактерий, но и всевозможные изменения, вызванные фагом.

Процесс взаимодействия фага с микробной клеткой проходит несколько стадий: адсорбция, проникновение в клетку, репродукция и выделение фагов.

Резистентность Фаги более устойчивы в воздействию внешних факторов, чем бактерии. Выдерживают нагревание до 75 С, переносят замораживание при -185 С, длительное время сохраняются при высушивании, переносят прямой солнечный свет до 2 – 3 дней, ультрафиолетовые лучи до 10 минут, сохраняют свою активность при рН от 2,5 до 8,5. Несмотря на относительную повышенную резистентность, фаги быстро погибают при кипячении, действии кислот, дезинфицирующих средств.

Распространенность фагов в природе Бактериофаги широко распространены в природе повсеместно там, где встречаются бактерии. Бактериофаги могут быть выделены из воды, почвы, молока, их можно обнаружить в организме людей и животных. Свойства фагов лизировать клетки патогенных бактерий было использовано для борьбы с различными заболеваниями. Из бактериофагов стали создавать соответствующие лекарственные средства.

Производство бактериофагов. Использование в медицине Для лечения и профилактики ряда инфекций наряду с вакцинами, антибиотиками и другими препаратами применяют вирусы бактерий – бактериофаги, обладающие высокой специфичностью к патогенным и условно- патогенным бактериям. Избирательность их действия значительно выше, чем антибиотиков и других химиотерапевтических средств. Бактериофаги не оказывают влияния на нормальную микрофлору организма человека.

Большую группу среди них составляют бактериофаги против кишечных инфекций: дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный, колипротейный. Бактериофаг дизентерийный (Bacteriophagum disentericum) препарат, активный в отношении дизентерийных бактерий Флекснера, Зонне и Ньюкасл, Штуцера Шмитца и Григорьева Шига. Применяют для лечения и профилактики дизентерии. Бактериофаг брюшнотифозный (Bacteriophagum salmonellae typhi) смесь бактериофагов, активных в отношении возбудителей брюшного тифа различных фаготипов. Препарат применяют для предупреждения заболеваний брюшным тифом людей, контактировавших с больным.

Бактериофаг стафилококковый (Bacteriophagum staphilococcicum) фильтрат фаголизата стафилококков. Его применяют местно для лечения гнойных заболеваний фурункулеза, гнойно- осложненных ран, абсцессов и др. При кишечных заболеваниях, связанных со стафилококком, бактериофаг вводится через рот или в клизмах подобно кишечным фагам. Развитие резистентных форм бактерий и осложнения, связанные с применением антибиотиков и сульфаниламидных препаратов, привели к широкому спросу на, так называемые, раневые бактериофаги – стафилококковый, стрептококковый, синегнойной палочки, протейный.

Бактериофаг стрептококковый (Bacteriophagum streptococcicum) – препарат, активный в отношении штаммов стрептококка различного происхождения. Применяют для лечения и профилактики кожных, хирургических стрептококковых инфекций, при ангине и др. Бактериофаг пиоцианеус (синегнойной палочки) (Bacteriophagum pyocyaneum) – препарат, активный в отношении штаммов синегнойной палочки. Применяют для лечения инфекций различных органов и кожных гнойных инфекций, вызванных синегнойной палочкой.

Технологический процесс производства жидких бактериофагов состоит из следующих этапов: подбора штаммов для производства данного вида фага получения маточных бактериофагов приготовления серий жидкого бактериофага контроля готового препарата на стерильность, безвредность и литическую активность, этикетировки и упаковки препарата

Рис. Графическая схема технологического процесса производства жидкого бактериофага 1 - пробирка для засева культуры; 2 - бутыль емкостью 3 л для засева культуры; 3 - емкость Боброва для составления нативной взвеси; 4 - много рамный фильтр (фильтрующий); 5 - реактор; 6 - бутыль емкостью 1 л со смесью маточных фагов; 7 -фильтр (стерилизующий); 8 - розлив препарата во флаконы;

Отобранные для производства штаммы должны обладать типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Для лучшего сохранения целесообразно после проверки свойств культур высушивать их под вакуумом из замороженного состояния (лиофилизировать) и хранить в темном месте при температуре °С. Производственная коллекция непрерывно пополняется свежевыделенными штаммами. Для получения маточных бактериофагов к пробам речных и сточных вод подсевают соответствующую культуру бактерии и после инкубации при 37°С фильтруют через стерилизующие фильтры. Литическая активность фильтратов проверяется титрованием в жидкой питательной среде (по Аппельману) с набором штаммов данного вида. Наиболее активные используют для приготовления маточных фагов.

Серийный бактериофаг готовят в реакторах емкостью от 250 до 500 л. Реакторы имеют паровую рубашку с разрешающим давлением 3 · 10 5 Па (3 атм), пропеллерную мешалку, спусковой вентиль и систему труб для аэрации среды. Реактор и все его части изготавливают из нержавеющей стали. В состав питательный сред для получения кишечных и раневых бактериофагов входят белковые основы в виде кислотных или ферментативных гидролизатов казеина, мяса (гидролизат Хоттингера, пептон Мартена). В качестве источника ростовых факторов используют мясные экстракты, чаще с добавлением глюкозы, значение рН среды устанавливают в пределах 7,27,6 в зависимости от вида бактерий, для которых специфичен бактериофаг.

В реактор с питательной средой (37°С) засевают нативную взвесь бактерий из расчета млн. клеток на 1 мл среды. Маточный фаг добавляют в количестве 0,01 0,1% объема питательной среды. Содержимое тщательно перемешивают воздухом. Воздух, подаваемый в биореактор под давлением, поступает через стерильный (ватно-угольный) фильтр с активированным углем. Лизис проходит при температуре 37°С в течение 4-10 ч (в зависимости от вида бактериофага). Полноту лизиса определяют визуально (по полноте прозрачности). По завершении процесса добавляют консервант хинозол (0,01%). Через 1,52 ч после добавления консерванта фаголизат фильтруют через стерилизующие пластины и разливают в стерильных условиях во флаконы по 100, 50 и 25 мл.

Технологический процесс производства сухих бактериофагов включает: Работу с производственными штаммами бактерий Получения маточных бактериофагов Приготовления серии жидкого бактериофага Получения серии сухого бактериофага Контроля готового препарата Этикетировки и упаковки препарата.

Для получения сухого бактериофага первые три стадии аналогичны. Затем проводится концентрация фага, его высушивание, таблетирование, нанесение кислотоустойчивого покрытия. Контроль сухого препарата проводится на специфическую стерильность, на наличие постоянных микроорганизмов, безвредность, литическую активность, остаточную влажность, растворимость в искусственном желудочном соке. Бактериофаг фасуется подобно другим таблетированным препаратам, этикетируется и упаковывается. Кроме таблетированной формы (по аналогии с другими фармакопейными формами) бактериофаг может готовиться на в виде мазей, гелей или в виде ректальных суппозиториев.

Концентрация жидкого бактериофага может проводиться путем высаливания сульфатом аммония, который добавляют в количестве 69% от объема фага. Высаливание продолжается 18 ч без последующего диализа при температуре (+2)(+4°С), рН 6,97,0. К образовавшейся пастообразной массе добавляют в качестве стабилизатора глюконат кальция (9%). Если защитным покрытием служит пектин, его добавляют одновременно с глюконатом кальция (3% к массе). Массу наносят на кассеты (толщина слоя 1 см) и высушивают из замороженного состояния под вакуумом в аппаратах для лиофилизации до достижения остаточной влажности 24%.

Концентрацию жидкого бактериофага также можно проводить методом ионообменной хроматографии с использованием волокнистой ДЭАЭ-целлюлозы. При этом профильтрованный бактериофаг разводят пополам стерильной очищенной водой и пропускают через хроматографичекие колонки с ДЭАЭ-целлюлозой. Затем проводят элюацию бактериофага 0,7-1,0 М раствором NaCl на 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,0-7,4) с добавлением 1 % сернокислого аммония. Концентрат стерильно собирают в емкости, добавляя в качестве стабилизатора 50 % обрата молока и 2 % глюкозы, затем подвергают лиофилизации.

Контроль препаратов бактериофагов Бактериофаги контролируют на специфическую стерильность, безвредность, литическую активность. У жидких бактериофагов определяют также общую стерильность, а у сухих, кроме перечисленных тестов, - обсемененность посторонней микрофлорой, устойчивость к действию желудочного сока, растворимость в кишечном соке и остаточную влажность. Высушенную массу измельчают в грануляторе, контролируют на специфическую стерильность, обсемененность посторонними микроорганизмами и литическую активность. В настоящее время бактериофаги выпускаются в широком ассортименте.

Стерильность фагов общую устанавливают путем посева препарата (10 флаконов от серии) на тиогликолевую среду (методика ГФ Украины). Для контроля специфической стерильности образцы из расчета 15 табл. из каждых табл. высевают на 10 % желчный бульон с последующим пересевом через 48 ч. на среды Плоскирева или Эндо. Степень загрязненности посторонней микрофлорой определяют на чашках с 2 % агаром. Среднее число колоний, выросших на всех чашках, не должно превышать 10. Стерильность жидких и сухих фагов определяют как общую, так и специфическую.

Безвредность проверяют путем подкожного введения 3 мышам массой г 1 мл препарата (таблетку предварительно растворяют в 20 мл воды очищенной). Бактериофаг не должен вызывать гибели мышей. Срок наблюдения 3 суток. Литическую активность определяют методом Аппельмана. Титрование проводят не менее, чем с 2 штаммами каждого вида и серотипа микроорганизмов, в отношении которых препарат должен быть активным. Для каждого вида бактериофага соответствующими ТУ предусмотрены допустимые минимальные титры.

Бактериофаг с оболочкой из ацетофталата целлюлозы испытывают на устойчивость в желудочном соке или 0,1 н растворе НСl при 37 0 С и растворимость в кишечном соке или 0,1 н растворе NaOH. Таблетки должны быть устойчивы к воздействию желудочного сока в течение 3 ч, время растворения в кишечном соке не должно превышать 30 мин. Остаточную влажность определяют высушиванием до постоянной массы навески размельченных таблеток. В готовом препарате остаточная влажность не должна превышать 7 %.

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!