1 Слагаемые биотехнологического процесса Структура производства

2 Главные особенности биотехнологического производства : два активных и взаимосвязанных представителя средств производства – биообъект и «ферментер»; чем выше темп функционирования биообъекта, тем более высокие требования предъявляются к аппаратурному оформлению процессов; оптимизации подвергают и биообъект и аппараты биотехнологического производства

3 Цели осуществления биотехнологии : 1. основной этап производства ЛС – получение биомассы (сырья, ЛВ); 2. один или несколько этапов производства ЛС (в составе химического или биологического синтеза) - биотрансформация, разделение рацематов и т.п.; 3. полный процесс производства ЛС – функционирование биообъекта на всех стадиях создания препарата.

4 Биотехнологии осуществляемые для получения сырья. макро-био-объекты (человек, животные, растения): высокоорганизованные живые системы, пластично приспособлены к абсолютно автономному существованию в условиях внешней среды получение биомассы (ткани, биожидкости, клетки) осуществляют в природных условиях (плантационное культивирование лекарственных растений, разведение змей в серпентариях и т.п.). микро-био-объекты не способны к автономному существованию во внешней среде, необходимо создать техногенную экологическую нишу для обеспечения: 1. условий для существования био-объекта в монокультуре; 2. экономически целесообразных темпов функционирования для получения необходимого количества биомассы; 3. защиты культуры-продуцента от внешних неблагоприятных факторов; 4. защиты культуры-продуцента от контаминации патогенной микрофлорой (лизогенный фаг для коклюшных бактерий, онкогенные вирусы для вируса полиомиелита); 5. защиты окружающей среды от выбросов патогенных штаммов- продуцентов (при получении ксантана фитопатогенный Xantomonas campestic, при получении витамина В2 гриб Eremothecium – паразит хлопчатника).

5 Биотехнологии осуществляемые в целях биотрансформации. био-объекты используют для осуществления определенной реакции. Задача: обеспечение способность биомассы осуществить то или иное превращение полупродукта в биологически активное вещество. Примеры: При получении витамина С одним из этапов синтеза является биологическая трансформация D-сорбита в L-сорбозу, с помощью бактерий Gluconobacter, при этом для достижения практически 100 % результата необходимо усиление дыхательной активности культуры, которое достигается не наращиванием биомассы, а усилением аэрации питательной среды и введением кукурузного или дрожжевого экстракта. При осуществлении биотрансформации за счет ферментативного катализа клетки культуры или молекулы фермента подвергают иммобилизации (связыванию с каким либо носителем), (не ограничивает трофических и функциональных возможностей биообъекта и позволяет использовать био- объект непрерывно или в нескольких повторностях без снижения темпов биотрансформации, но жестко ограничивает размножение клеток культуры, а в случае иммобилизации фермента стабилизует его каталитическую активность).

6 Биотехнологии при получении конечного БАВ весь процесс получения препарата осуществляется био-объектом. Задача: на первом этапе - получение биомассы, на втором этапе – реализация условий для осуществления биосинтеза с обеспечением выхода конечного продукта (БАС). Пути: 1. Накопление биомассы - за счет компонентов пластического обмена в составе питательной среды (до достижения культурой-продуцентом стационарной фазы роста). 2. Инициация синтеза - в зависимости от штамма-продуцента: –Фото-возбуждение при получении β-каротина с помощью гриба Phycomyces blakeslecanus; –Ограничение энергообеспечивающих компонентах при получении акарбозы с помощью микроорганизмов рода Actinoplanes; –Введение предшественников (синтез антибиотиков, витамина В12 – примеры в следующих лекциях).

7 Условия осуществления биотехнологий при производстве ЛП 1. Генетически обусловленная способность био- объекта к синтезу или специфической трансформации связанной с получением БАВ или ЛС; 2. Защищенность био-объекта в биотехнологической системе от внутренних и внешних факторов; 3. Обеспечение функционирующих в биотехнологических системах био-объектов пластическим и энергетическим материалом в объемах и последовательности, гарантирующих нужную направленность и темп биотрансформации.

8 Биотехнологические процессы Биологические – основаны на использовании клеток эукариот, прокариот, эукариот; Биохимические основаны на использовании ферментов; Биоаналогичные – основаны на химическом синтезе или полу синтезе веществ функционально близких или эквивалентных первичным или вторичным метаболитам живых организмов (производные цефалоспорина, пенициллина, тетрациклина, нуклеиновых оснований)

9 В каждом из вариантов поставленной цели оперируют взаимосвязанными потоками: 1. информационным 2. энергетическим 3. технологическим В традиционных биотехнологиях – использующих ткани макрообъектов два последних потока - спонтанные процессы. В современных биотехнологиях - для ускорения сроков созревания меристемных культур, укорочения промежуточных стадий синтеза – технологический и энергетический потоки существенно модернизируются. –биообъекты: селекция продуцентов, генно-инженерное совершенствование, переход на иммобилизацию, сверхсинтез, и т.д., –усложнение аппаратов осуществляющих энергетическое и пластическое обеспечение элементной базы биотехнологического процесса.

10 Иерархия биотехнологических процессов Первая ступень – биообъекты в совокупности с управляемыми биореакторами. Вторая ступень – объединения взаимосвязанных технологических процессов и аппаратов в единую технологическую цепочку (цех). Третья ступень – опытно-промышленная установка или предприятие законченного цикла, т.е. основные и вспомогательные (общеинженерные) подсистемы.

11 Сопоставляя структуры производства разной направленности (исходя из задач) элементы первой ступени в любом случае одинаковы: биообъект, биореактор, системы асептики, – подачи пластического и энергетического материала, – разделения продуктов ферментации и т.п. основные различия на второй ступени иерархии –очистка целевого продукта –выведение побочных продуктов особенно на уровне организации вспомогательных подсистем (контроль качества).

12 Схема ферментера.

13 Методы ферментации Ферментация Глубинная Периодические Твердофазная поверхностная Непрерывная Клетки Суспендированные клетки Иммобилизованные клетки Ферменты Иммобилизованные ферменты Ферменты в растворе

14 Рассмотрим биосинтез в самом общем виде: продуцент - биообъект микроуровня Общая технология в предлагаемых условиях подразделяется на ряд основных и вспомогательных операций

15 Вспомогательные операции: Подготовка посевного материала или инокулята: засев пробирок, качалочных колб (1-3 сут), инокулятора (2-3 % 2-3 сут), посевного аппарата (2-3 сут). Кинетические кривые роста микро биообъектов в закрытых системах имеют сложный характер 1. индукционный период (лаг-фаза) 2. фаза экспоненциального роста (накопление биомассы и продуктов биосинтеза) введение биообъекта в систему dN/dt= N N – число клеток, t - время, - коэффициент пропорциональности (удельная скорость роста) 3. фаза линейного роста (равномерный рост культуры) 4. фаза замедленного роста 5. стационарная фаза (режим постоянства числа жизнеспособных особей 6. Фаза старения культуры (отмирания) N t

16 Инкубационная - качалка

17 Подготовка питательной среды для производственного культиватора 1. выбор и реализация рецептуры среды, 2. стерилизация гарантирующая сохранность всех пластических и энергетических компонентов, в исходном количестве и качестве. Особенностью биообъектов является потребность в многокомпонентных энергетических и пластических субстратах, содержащих О, С, N, Р, Н – элементы необходимые для энергетического обмена и синтеза клеточных структур.

18 Содержание биогенных элементов в различных биообъектах, в % Микро- организмы элемент углерод азот фосфор кислород водород бактерии 50,412,34,030,56,8 дрожжи 47,810,44,531,16,5 грибы 47,95,23,540,46,7 Элементный состав биомассы по химическим элементам позволяет сделать для каждого биообъекта описание в виде выражения: (на примере дрожжей) Вдрожжи = С3,92*Н6,5*О1,94*N0,7*Р0,14 (числовые коэффициенты получены делением массовой доли элемента в биомассе на атомную массу данного элемента)

19 Существует количественная закономерность влияния концентрации элементов питательной среды на скорость роста биомассы, равно как и взаимовлияние тех же элементов на удельную скорость роста биообъектов. Влияние любого из компонентов выражается графически и в виде уравнения: (с) = ь*С / (Кs + С) уравнение Моно. - коэффициент пропорциональности, с- концентрация расходуемого компонента среды, ь - предельная максимальная удельная скорость роста биообъекта Кs – константа сродства субстрата к биообъекту. С DN/dT 123 C – концентрация лимитирующего компонента DN/dT – скорость роста микроорганизмов. 1 -область лимитирования, 2- область оптимального роста, 3 – область ингибирования.

20 Стерилизация питательной среды необходимо полностью исключить контаминантную флору и сохранить биологическую полноценность субстратов чаще автоклавирование, реже химические и физические воздействия. Эффективность выбранного режима стерилизации оценивают по константе скорости гибели микроорганизмов (берется из специальных таблиц) умноженная на продолжительность стерилизации. Контроль стерилизации осуществляется с помощью тест- культуры Bacillus stearothermophilus штамма 1518, считается что абсолютная стерильность достигается при критерии стерилизации 80. При наличии термолабильных компонентов стремятся сократить время обработки при повышении температуры выше 140 С изменение лабильности можно достичь например сдвигом рН для глюкозы 3,0 для сахарозы 8,0.

21 Подготовка ферментера. Стерилизация оборудования острым паром. Герметизация с особым вниманием к «слабым» точкам тупиковые штуцера малого диаметра, штуцера датчиков контрольно-измерительной аппаратуры. Выбор ферментера осуществляется с учетом критериев дыхания биообъекта, теплообмена, транспорт и превращения субстрата в клетке, скорость роста единичной клетки, время ее размножения и т.п.

22 Основные операции: Стадия биосинтеза, где в максимальной степени используются возможности биообъекта для получения лекарственного продукта (накапливается внутри клетки или секретируется в культуральную среду). Стадия концентрирования, одновременно предназначена для удаления баласта. Стадия очистки, реализующая за счет повтора однотипных операций или за счет набора различных препаративных приемов (ультрафильтрация, экстракция, сорбция, кристаллизация и т. п) повышение удельной специфической активности лекарственного продукта. Стадия получения конечного продукта (субстанции или готовой лекарственной формы) с последующими операциями фасовки и упаковки.

23 Промышленное ферментационное оборудование

24 Biostat A plus - автоклавируемый ферментер со сменными сосудами (рабочий объем 1,2 и 5 л) для культивирования микроорганизмов и культур клеток и является полностью масштабируемым при переходе к большим объемам. единый корпус с интергрированным оборудованием измерения и управления, насосами, системой температурного контроля, подачи газа и мотором ноутбук с заранее установленным Windows совместимым программным обеспечением MFCS / DA для управления процессами ферментации и их документирования

25 КОМПЛЕКТАЦИЯ ФЕРМЕНТЕРА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК: - ВСТРОЕННАЯ СИСТЕМА СМЕШЕНИЯ ДО ЧЕТЫРЕХ ВИДОВ ГАЗА (O2, N2, CO2 И ВОЗДУХА) - ПОДАЧА ГАЗА ВЫБРАННОГО СОСТАВА - УПРАВЛЕНИЕ УРОВНЕМ РАСТВОРЕННОГО КИСЛОРОДА DO ПОСРЕДСТВОМ АВТОМАТИЧЕСКИХ КЛАПАНОВ ДЛЯ ВОЗДУХА И О2 - УПРАВЛЕНИЕ УРОВНЕМ РН ПОСРЕДСТВОМ СО2, КИСЛОТЫ ИЛИ ОСНОВАНИЯ - СПЕЦИАЛЬНОЕ УСТРОЙСТВО ИМПЕЛЛЕРА ДЛЯ БЕРЕЖНОГО ПЕРЕМЕШИВАНИЯ КУЛЬТУР Комплектация ферментера для выращивания микроорганизмов: - Система подачи воздуха - Опционная возможность обогащения кислородом - Эффективная система перемешивания клеток с высокими плотностями - Автоматичесое управление уровнем растворенного кислорода DO посредством автоматических клапанов для возуха и перемешивания, добавления субстрата и опционного обогащения кислородом