Предназначено исключительно для учебных целей January 17, ДЕЛАЕМ НАУКУ ЛУЧШЕ ВМЕСТЕ С AGILENT Высокоэффективная жидкостная хроматография. Теоретические основы

Предназначено исключительно для учебных целей January 17, Компания Agilent Technologies поддерживает тесную связь с образовательным сектором и готова делиться имеющимися у нее информационными материалами. Данная презентация разработана компанией Agilent Technologies. Слайды могут быть использованы только в учебных целях. Прежде чем использовать изображения, хроматограммы или графики в каких-либо других целях, заблаговременно предупредите об этом компанию Agilent Technologies.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 3 Введение Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, жидкостная хроматография высокого давления) это методика, используемая в аналитической химии для разделения компонентов смеси, их идентификации и количественного определения. Инструментально методика ВЭЖХ основывается на механизме, в котором насосы прогоняют элюент с анализируемой смесью под давлением через разделительную колонку, наполненную твердым адсорбирующим материалом. Каждый из компонентов пробы по-своему взаимодействует с адсорбирующим материалом, при этом скорость потока каждого компонента различна, что позволяет разделить эти компоненты в процессе их прохождения через колонку. Источник: Wikipedia

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 4 Содержание (содер.) Введение Что происходит внутри колонки? Основные параметры Время удерживания и ширина пика Разрешение разделение по базовой линии Разрешение базовое уравнение Эффективность или число теоретических тарелок Эффективность или число теоретических тарелок Коэффициент удерживания Селективность или коэффициент разделения Как повлиять на разделение? Разделение пример 1 Разделение пример 2 Разделение пример 3 Число тарелок Уравнение Ван-Деемтера Вихревая диффузия Осевая диффузия Сопротивление переносу вещества Подробнее об уравнении Ван-Деемтера Емкость пиков Градиентный анализ Определение Расчет емкости пиков Ширина пика Пример

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 5 Введение Что происходит внутри колонки? Время t Разделение t у 2 –t у 1 Ширина пика W б 1,2 содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 6 Введение Что происходит внутри колонки? t у 2 -t у 1 Хорошее разделение Плохое разделение Хорошее разделение Плохое разделение W б 1 W б 2 W б 1 W б 2 t у 2 -t у 1 содер.

17 stycznia 2016 Метка конфиденциальности 7 Время t Разделение t у 2 –t у 1 Ширина пика W б 1,2 Введение Что происходит внутри колонки? Разрешение описывает возможность колонки разделять целевые пики. Разрешение показывает, насколько успешно проведено разделение по базовой линии. содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 8 Основные параметры Время удерживания и ширина пика t у 1 t у 2 W б 1 W б 2 W 1/2 h t t уi время удерживания соединения «i» W 1/2 ширина пика на середине высоты W бi ширина пика на уровне базовой линии содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 9 Основные параметры Разрешение разделение по базовой линии Разрешение описывает возможность колонки разделять целевые пики. При расчете разрешения учитывается эффективность (N), селективность ( ) и удерживание (k). Для проведения количественного анализа минимальным измеряемым значением разделения является 1. Для выявления точки минимума между двумя пиками равной высоты необходимо значение 0,6. В целом для обеспечения надежности метода предпочтительны значения от 1,7 и выше. Значение 1,6 считается показателем разделения по базовой линии и обеспечивает точность количественного анализа. h t R р = 1,5 содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 10 Основной параметр Разрешение базовое уравнение (У)ВЭЖХ Селективность ЭффективностьУдерживание Разрешение можно улучшить путем оптимизации любого из указанных параметров: Самое сильное влияние оказывает селективность. Небольшие изменения селективности приводят к значительным изменениям разрешения. Изменение удерживания становится значимым только при низких значениях k. Эффективность характеризует способность разделения колонки. содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 11 Основной параметр Разрешение базовое уравнение (У)ВЭЖХ График описывает зависимость разрешения от селективности, эффективности колонки и удерживания. Селективность сильнее всего влияет на разрешение Изменение неподвижной фазы Изменение подвижной фазы Проще всего увеличить число тарелок содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 12 Основной параметр Эффективность или число теоретических тарелок (N) Для сравнения результатов колонок используется показатель эффективности колонки. Он выражен числом теоретических тарелок N. Чем больше число тарелок, тем эффективнее колонка. У колонки с большим числом N при заданном времени удерживания ширина пика уже, чем у колонки с меньшим числом N. Параметры, влияющие на эффективность колонки: Длина колонки (увеличение длины колонки повышает эффективность) Размер частиц (снижение размера частиц позволяет повысить эффективность) содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 13 Основной параметр Коэффициент удерживания (k) Коэффициент удерживания является отношением скорости движения вещества к скорости движения подвижной фазы. Коэффициент удерживания характеризует долю времени нахождения вещества или долю вещества в подвижной фазе (t 0 ). Параметры, оказывающие влияние на коэффициент удерживания: неподвижная фаза подвижная фаза профиль градиента* мертвый объем системы* *только при градиентном элюировании содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 14 Данное уравнение отображает зависимость коэффициента удерживания от скорости потока (F), времени градиента (t г ), диапазона градиента (ΔΦ) и объема колонки (V к ). Запомните: для поддержания постоянного значения коэффициента удерживания изменения в знаменателе должны компенсироваться пропорциональными изменениями числителя и наоборот. Основной параметр Коэффициент удерживания (k) – градиентное элюирование содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 15 Основной параметр Селективность или коэффициент разделения (α) Селективность является мерой измерения времени или расстояния между максимальными точками двух пиков. При α = 1 оба пика имеют одинаковое время удерживания и элюируются совместно. Селективность является отношением коэффициентов емкости. Параметры, оказывающие влияние на коэффициент удерживания: неподвижная фаза подвижная фаза температура селективность k 1 коэффициент удерживания 1-го пика k 2i коэффициент удерживания 2-го пикассо дер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 16 Основной параметр Влияние N, α, и k на разрешение содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 17 Как повлиять на разделение? Данные одной пробы, проанализированной в различных неподвижных фазах при постоянной температуре, подвижной фазе и градиенте. содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 18 Как повлиять на разделение? Данные одной пробы, проанализированной при постоянной неподвижной фазе и температуре, но с разными подвижными фазами (с одинаковым градиентом). содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 19 Данные одной пробы, проанализированной при постоянных неподвижной и подвижной фазах, постоянном градиенте, но при различной температуре. Как повлиять на разделение? содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 20 Как повлиять на разделение? Что такое «тарелка» в ВЭЖХ? Теоретическая тарелка это гипотетическая стадия, в которой две фазы вещества (жидкая и парообразная) находятся в равновесии. L к длина колонки d ч размер частицы hприведенная высота теоретической тарелки содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 21 Как повлиять на разделение? Преимущества большого числа тарелок (N): острые и узкие пики; лучшее качество обнаружения; емкость пиков, достаточная для анализа проб сложного состава. Но разрешение растет как квадратный корень из числа тарелок. R р ~ N Увеличение числа тарелок может быть ограничено условиями проведения анализа: временем анализа и давлением содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 22 Как повлиять на разделение? Объединение формул ширина пика и приведенная высота теоретической тарелки h приведенная высота теоретической тарелки содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 23 Уравнение Ван-Деемтера Вихревая диффузия w вихрьь ~ λ d ч λ качество наполнения колонки Причины расхождения диффузионных путей: Различные пути Плохое наполнение колонки Различный размер частиц содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 24 Уравнение Ван-Деемтера Осевая или продольная диффузия Ширина пика увеличивается из-за самодиффузии анолита. При небольшом потоке аналит остается в подвижной фазе достаточно долго. Увеличение ширины пика Увеличение приведенной высоты теоретической тарелки Поток содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 25 Уравнение Ван-Деемтера «Сопротивление переносу вещества» w С ~ d ч 2 Различные диффузионные пути Пористая частица Неподвижный слой подвижной фазы содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 26 Уравнение Ван-Деемтера Уравнение Ван-Деемтера связывает высоту тарелки хроматографической колонки с линейной скоростью подвижной фазы и дает высоту тарелки как сумму трех членов, учитывающих вклады молекулярной продольной диффузии, вихрььевой диффузии и сопротивления массопередаче (Wikipedia). h = f ( w вихрьь + w ос + w С ) h = A + B/u + C u Вихревая диффузия Коэффициент диффузии Сопротивление массопередаче содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 27 Уравнение Ван-Деемтера Приведен. высота теор. тарелки (h) Поток Кривая суммы уравнение Ван-Деемтера Осевая диффузия Вихревая диффузия Сопротивление массопереносу h = A+ B/u+ C u содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 28 Уравнение Ван-Деемтера Расчет для различных размеров частиц 5,0 мкм 3,5 мкм 1,8 мкм Малый размер частиц дает меньшую высоту теоретических тарелок, и, следовательно, лучшую эффективность разделения. Эффективность разделения с малыми частицами выше при увеличении скорости потока. содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 29 Уравнение Ван-Деемтера Реальные кривые для различных аналитов P. Petersson et al (AZ), J.Sep.Sci, 31, , 2008 Уравнение Ван- Деемтера только для изократических анализов Специфика соединений и оборудования Даже для частиц <2 мкм не горизонтально Оптимальная скорость потока зависит от соединения содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 30 Изократический анализ Ширина пика зависит только от процесса диффузии. Градиентный анализ Ширина пика зависит от процесса диффузии и фокусировки градиента на верхней части колонки. Емкость пиков Градиентный анализ Приведенная высота теоретической тарелки в виде функции ширины пикассо дер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 31 Емкость пиков это количество пиков (n), выделяемых за заданное время при заданном разрешении. Емкость пиков зависит от различных факторов, таких как длина колонки и размер частиц. Емкость пиков Определение Емкость пиков 32 пика за 2,5 мин содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 32 Емкость пиков Значение « … при использовании статистической теории перекрывания пиков …» «… разделение пиков значительно ухудшается, когда число компонентов пробы превышает 1/3 емкости пиков.» J.M. DAVIS, J.C. GIDDINGS, ANAL. CHEM. 55 (1983) 418 …чтобы разделить 98% компонентов, емкость пиков должна превышать количество компонентов в сто раз. J.C. GIDDINGS, J. CHROMATOGR. A 703 (1995) 3 содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 33 Емкость пиков Расчет емкости пиков Упрощение : w ср средняя ширина пика nколичество пиков t Г время градиента wширина рассматриваемого пикассо дер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 34 Емкость пиков Ширина пика Ширина пика по методу касательной Ширина пика на середине высоты Ширина пика на 5% высоты Ширина пика на 4,4% высоты (5σ) содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 35 Емкость пиков Пример мин mAU Колонка: 2,1 x 150 мм, 1,8 мкм Обратное давление: 402 бар Емкость пиков: 313 Колонка: 2,1 x 300 мм*, 1,8 мкм Обратное давление: 598 бар Емкость пиков: 406 *колонка 300 мм объединяет две колонки по 150 мм содер.

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 36 Дополнительная информация Более подробную информацию о продукции Agilent см. на сайте или Появились вопросы или предложения, касающиеся презентации? Пишите по адресу: Публикация Название пуб. СправочникThe LC Handbook EN Методическая информация The influence of silica pore size on efficiency, resolution and loading in Reversed-Phase HPLC EN Методическая информацияIncreasing resolution using longer columns while maintaining analysis time EN Переиздание статьи A simple approach to performance optimization in HPLC and its application in ultrafast separation development Постер Study of physical properties of superficially porous silica on its superior chromatographic performance Методическая информация Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using gradient parameters EN Методическая информацияMaximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC EN Методическая информацияIncreased peak capacity for peptide analysis with the Agilent 1290 Infinity LC system EN Ссылка CHROMacademyCHROMacademy бесплатный доступ к онлайн-курсам для студентов и преподавателей университетов содер.

Предназначено исключительно для учебных целей January 17, Спасибо за внимание содер RU

January 17, 2016 Предназначено исключительно для учебных целей 38 Сокращения Сокращение Определение αСелективность dчdч Размер частиц ΔΦДиапазон градиента FСкорость потока h Приведенная высота теоретической тарелки, измерение разрешающей способности колонки k Коэффициент удерживания (ранее известный как k` коэффициент емкости) LкLк Длина колонки λКоэффициент наполнения колонки NЭффективность или число тарелок колонки PЕмкость пиков RРазрешение Сокращение Определение t Время tуtу Время удерживания t0t0 Мертвое время колонки tГtГ Время градиентного элюирования VКVК Объем колонки w Ширина пика W 1/2 Ширина пика на середине высоты W бi Ширина пика на уровне базовой линии w вихрьь Вихревая диффузия w ос Осевая или продольная диффузия wCwC Сопротивление массопереносу w ср Средняя ширина пикассо дер.