Профессор Хрусталева Л.И. Технология рекомбинантных ДНК Лекция 3 С использованием ряда слайдов, подготовленных к.б.н. Фесенко И.А

Клонирование ДНК in vivo Вектор Размер клонируемой ДНК плазмида 20 kb космида 40 kb BAC 300 kb YAC 1000 kb

Космиды – векторы, созданные путем вставки COS последовательности от фага в небольшую (5 kb) плазмиду. Клонирование осуществляют в E. coli. BAC (Bacterial Artificial Chromosome) – векторы (кольцевые), созданные на основе бактериальной F-плазмиды. Клонирование осуществляют в Е. coli. YAC (Yeast Artificial Chromosome) – векторы (линейные), представляющие собой искусственную дрожжевую хромосому, в состав которой входит дрожжевые ориджин репликации, теломеры, центромеры и вставленный участок геномной ДНК животного. Клонирование осуществляют в дрожжевых клетках.

Секвенирование ДНК – определение последовательности нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК

Секвенирование ДНК

Саузерн-блоттинг Фрагменты хромосомной ДНК после рестрикции Разделение фрагментов в гель- электрофорезе Радиоактивно меченная ДНК-зонд Денатурация и перенос одноцепочечных фрагментов ДНК (блоттинг) Фрагмент ДНК, комплементарный ДНК-зонду

Саузерн-блоттинг Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарушениями какого-то одного гена Дородовая диагностика наследственных болезней Серповидноклеточной анемия – нуклеотидная замена в β-цепи гемоглобина GAG на GTG ДНК здорового плода ДНК плода с серповидноклеточной анемией GAG GTG GAGGTG

Нозерн-блоттинг Молекулы иРНК Разделение фрагментов в гель- электрофорезе Радиоактивно меченная ДНК-зонд Перенос РНК на мембрану (блоттинг) Молекула иРНК, комплементарная ДНК-зонду

Полимеразная цепная реакция ПЦР

ПЦР – быстрый и эффективный метод, позволяющий in vitro амплифицировать, или делать много копий, небольших фрагментов ДНК Полимеразная цепная реакция была изобретена в середине 80-х годов имела революционное значение для молекулярной биологии, медицинской диагностики, судебной экспертизы, эволюционной биологии и мн.др. Cary Mullis во время вручения Нобелевской премии в 1993

В ПЦР используются особенности репликации ДНК: ДНК-полимераза -для копирования ДНК используется ДНК-полимераза - - однонитевая ДНК-матрица (получают нагреванием раствора ДНК) праймеров - точка начала копирования определяется с помощью праймеров - ДНК-полимераза - ДНК-полимераза использует нуклеотиды для строительства новых цепей

праймеру ДНК-полимераза начинает копирование присоединением нуклеотидов к праймеру праймер Праймер Праймер – одноцепочечный фрагмент ДНК, образующий затравку на ДНК-матрице

ПЦР реакция включает в себя 3 этапа: Денатурация Денатурация – на этом этапе создается одноцепочечная ДНК, при температуре 94 0 С Отжиг праймеров Отжиг праймеров – на этом этапе праймеры гибридизуются с матричной ДНК, создавая затравку Элонгация Элонгация – на этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новые цепи (при температуре 72 0 С)

денатурацию отжиг праймеров удлинение праймеров Повторяющиеся циклы, включающие денатурацию ДНК-мишени, отжиг праймеров, последующее удлинение праймеров дают огромное количество ДНК

Изначально, для ПЦР использовалась ДНК-полимераза кишечной палочки, но этот фермент чувствителен к температуре и разрушается при денатурации ДНК. Важное усовершенствование техники ПЦР произошло после открытия бактерий, живущих в горячих источниках. ДНК-полимераза этих бактерий работает при температуре 72 0 С. ДНК-полимераза выделенная из этих бактерий называется Taq-полимераза. Начальный материал для ПЦР это небольшое количество ДНК ( может быть даже одна молекула ДНК), содержащая нуклеотидную последовательность, которую необходимо клонировать.

термостабильна не обладает 3-5 экзонуклеазой активностью

Диагностика инфекционных заболеваний Преимущества применения ПЦР: 1. ПЦР выявляет специфическую ДНК возбудителя и прямо указывает на возбудителя инфекции Области применения ПЦР

2. Высокая чувствительность – ПЦР дает возможность обнаруживать патогенные бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими методами их выявление невозможно. 3. Высокая специфичность – в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК 4. Быстрота получения результата – определение возбудителя занимает около 1 дня 5. Работа с любым биологическим материалом – возможна детекция в материале полученном от больного животного 6. Безопасность работы с исследуемым материалом – материал может быть дезинфицирован перед работой

ПЦР также используется для определения микробиологического загрязнения в продовольствии, косметике, лекарственных препаратах. Разработаны наборы для диагностики загрязнения сальмонеллой, стафилококком, листерией. В ветеринарии используют наборы для определения туберкулеза, сибирской язвы, чумы свиней, чумы плотоядных, хламидиоза, микоплазмоза у птиц, бешенства Срок диагностики составляет 8-10 часов

В палеонтологии С помощью ПЦР можно амплифицировать ДНК из ископаемых остатков. Например, из листьев растения обнаруженных в пластах миоцена (около 18 млн.) была выделена ДНК и использована для ПЦР. Была клонирована часть гена 1,5-рибулозобифосфат карбоксилазы. На основе данных о нуклеотидном составе этого участка растение было отнесено к семейству Магнолиевых

Маркирование геномов животных Целью широкомасштабного картирования генов на хромосомах с/х животных является разработка молекулярно-генетических маркеров, тесно сцепленных с главными генами хозяйственно-ценных признаков Молекулярные маркеры позволяют получать информацию об изменчивости генов и выявлять отдельные гены и генные ансамбли, несущие желательный комплекс признаков

Маркер – это «метка», которая может быть использована для идентификации определенных генов и локализации их относительно друг друга хромосома ценный ген ПЦР – продукт определенной длины Нет ПЦР продукта

Преимущества ДНК-маркеров: -маркирование можно проводить в любой стадии роста, экономя время, место и ресурсы -признаки, например устойчивость к болезням могут быть оценены вне зависимости от наличия инфекции -ДНК-маркеры выявляют полиморфизм в ДНК, поэтому возможно исключить влияние окружающей среды на выражение признака Удобный ДНК-маркер должен обладать следующими признаками: -должен быть дешевым и легко используемым - тесно сцеплен с маркируемым признаком - должен выявлять гетерозиготы (быть ко доминантным)

Маркирование количественных признаков (QTL) Среди генов, контролирующих молочную продуктивность и качество молока выделяют группу генов вносящих наибольший вклад в этот количественный признак: S1-казеин, -казеин, -лактоглобулин Аллель – одна из двух (или нескольких) альтернативных структурных форм гена Для получения молока, идеального для производства сыра, необходимо проводить селекцию коров по таким генотипам: S1 – казеин СС (плотный сгусток) - казеин ВВ или СС (хорошее сычужное свертывание) - лактоглобулин ВВ (высокая массовая доля казеина)

GCGC CGCG GCGT CGCA CGCG CGCG CGCG TАTА TАTА TАTА Анализ злокачественной гипертермии у свиней

Больное животное Скрытый носитель мутантного гена Здоровое животное Электрофореграмма

Паспортизация животных Паспортизация или соответствие с/х животных тем или иным породам Для каждой породы имеется свой набор генетических маркеров, которые выявляются с помощью ПЦР ,6 исходные родители 2-5 потомство

Выявление генетических заболеваний на ранних стадиях развития Широкий обмен генетическим материалом между разными странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у представителей коммерческих пород У телят голштинской породы недавно обнаружена генетическая болезнь BLAD – дефицит адгезивности лейкоцитов. Единственным существующим в настоящее время методом, позволяющим безошибочно выявить носителей мутантного гена, является ПЦР-анализ, с последующей рестрикцией. Установлено, что 15% племенных быков голштинской породы в Америке является носителем данной мутации. Ежегодные убытки в результате гибели больных телят составляют 5 млн. долларов

Исследования в молекулярной биологии и генетике ПЦР широко используется в научных исследованиях.ПЦР применяется в эволюционной биологии, клонировании генов, мутагенезе in vitro, изучении структуры геномов и многих других исследованиях

Проверь себя! 1. Опишите свойства ферментов, которые осуществляют клонирование ДНК, секвенирование ДНК, ПЦР и получение кДНК. 2. Как можно выделить определенную последовательность ДНК из геномной ДНК? 3. Фрагмент ДНК имеет следующую последовательность 3-GGCGTATTC-5. Он отсеквенирован с помощью ферментного метода. Сколько бэндов всего будет на геле? Сколько бэндов и каков их размер будет при электрофорезе в каждой из четырех смесей?

4. Какие различия между Саузерн-, Нозерн-, Вестерн- и дот- блоттингами? 5. Какие последовательности ДНК содержит библиотека кДНК? 6. Можно ли последовательность белка определить с помощью библиотеки геномной ДНК? 7. Как иРНК может быть переведена в кДНК? 8. Будет ли зависеть ПЦР продукт от: а) направленности праймеров, б) сиквенса праймеров, в) Тm праймеров?