Лекция 5. Культивирование клеток. Получение суспензионной культуры 1. Суспензионные культуры 2. Культивирование одиночных клеток 3. Культуры изолированных протопластов 4. Клеточные технологии для получения экономически 5. важных веществ растительного происхождения

1. Суспензионные культуры Под суспензионными культурами понимают культуры, выращиваемые в жидкой питательной среде во взвешенном состоянии и состоящие из отдельных клеток и их агрегатов. Для поддержания клеток во взвешенном состоянии при глубинном культивировании их перемешивают с помощью различных аппаратов.

Суспензионные культуры имеют множество преимуществ по сравнению с каллусной тканью, выращиваемой на газированной поверхности: более широкие возможности для изучения влияния экзогенных факторов на метаболизм и рост клеточных популяций, поскольку клетки в одинаковой степени становятся доступными для внешнего воздействия; надежное длительное поддержание линии вследствие простоты процессов субкультивирования; удобство для проведения биохимических и молекулярно–биологических исследований, а также быстрой регенерации растений; возможность неограниченного набора биомассы для получения БАВ.

Для получения суспензионных культур чаще всего используют каллусную ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при помещении ее в перемешиваемую жидкую среду. С этой целью при культивировании каллуса из среды исключают цитокинины или снижают их концентрацию, а концентрацию ауксинов увеличивают.

Клеточные суспензии обычно требуют регулярного и более частого субкультивирования, чем каллусные культуры. Часть суспензионной культуры, используемая для пересадки на свежую среду, называется инокулюм. Для каждой линии культуры клеток существует минимальный размер инокулюма, при уменьшении объема которого культура не растет.

Суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50–60 %, остальное приходится на долю групп из 2–10 клеток и многоклеточные агрегаты. В зависимости от степени агрегированности выделяют -слабо агрегированные (до 5–10 клеток), -средне агрегированные (более 10 клеток) и -высоко агрегированные суспензии (более 50 клеток в агрегате).

Хорошей считается суспензия, состоящая из морфологически выравненных клеток, имеющих небольшие размеры и агрегированных в мелкие группы, включающие не более 10 клеток. Для выращивания клеточных суспензий используют те же питательные среды, что и для каллусных культур. Однако в настоящее время создан ряд сред, предназначенных непосредственно для выращивания суспензионных культур.

Культивирование клеток в жидкой среде осуществляется несколькими способами Наиболее простым и распространенным является накопительное или периодическое культивирование.

2. Культивирование одиночных клеток Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции очень ценным является культивирование одиночных клеток. Например, вопрос о генетической неоднородности легче решать, используя клон – потомство одной клетки, а не гетерогенную ткань исходного эксплантат.

Для выделения одиночных клеток используют низко агрегированные суспензии, из которых отбирают отдельные клетки. Изолирование клеток также можно производить непосредственно из тканей целого растения после их предварительной мацерации. Наилучшим способом получения одиночных клеток является использовании изолированных протопластов после восстановления ими клеточной стенки. Мацерация разъединение растительных клеток в тканях. Естественная мацерация результат растворения межклеточного вещества.

«кондиционирующего фактора». Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночные клетки делится, разработаны специальные методы. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего фактора».

Активно делящиеся клетки не только адсорбируют питательные вещества из среды, но и каким-то образом изменяют, «кондиционируют» ее, выделяя продукты собственной биосинтетической деятельности, способствующие росту одиночных клеток. Отдельная клетка должна получить сигнал в виде фактора кондиционирования от соседних клеток, и только тогда деление индивидуальной клетки становится возможным

Этой цели служат следующие методы: 1. Метод ткани -«няньки» – кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки».

2. Метод «кормящего слоя» – кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка 1 – колонии клеток; 2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая сетка; 4 – пенополиуретан; 5 – суспензия клеток.

3. Кондиционирование среды путем добавления питательной среды от интенсивно делящейся культуры клеток. 4. Метод культивирования одиночных клеток в микро капле, т.е. очень малом объеме (~20 мкл) богатой, оптимально сбалансированной по составу питательной среды.

3. Культуры изолированных протопластов Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке.

Изолированные протопласты – одни из наиболее ценных объектов в биотехнологии. Несомненным преимуществом протопластов является удобство их использования в качестве модели для изучения транспорта различных веществ и ионов через плазмалемму, электрических свойств мембраны и воздействия на нее физических и химических факторов.

Впервые протопласты растений были выделены Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза во время механического повреждения ткани, в связи с чем метод был назван механическим. Он позволяет выделить лишь небольшое количество протопластов, характеризуется достаточно низкой эффективностью и высокой трудоемкостью. Современный метод выделения протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью ферментов, ее разрушающих (целлюлазы, гемицеллюлозы, пектиназы). Этот метод получил название ферментативного. Первое успешное выделение протопластов из клеток высших растений данным методом было сделано Е. Коккингом в 1960 г. По сравнению с механическим ферментативный метод имеет ряд преимуществ. Он позволяет сравнительно легко и быстро выделять большое количество протопластов, которые не испытывают сильного осмотического шока.

Источники получения протопластов Суспензионные культуры и каллусная ткань. Изолированные органы растений и их части листья, семядоли, корни, гипокотили, лепестки, пыльцевые зерна В клетках разных типов тканей в зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений соотношения различных компонентов клеточной стенки (целлюлоза, гемицеллюлоза, пектиновые вещества, белки) могут варьировать. Поэтому типы ферментных препаратов специфичны для каждого вида клеток.

При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты, а затем подвергают энзиматической обработке

После энзиматической обработки суспензия протопластов очищается от остатков не разрушенной ткани и осколков клеток, отмывается от ферментов. Для этого используется техника фильтрации- центрифугирования. После удаления ферментов следует высев протопластов на питательную среду с добавлением маннита или сорбита. Среда должна быть несколько гипертоничной, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Наличие осмотического стабилизатора необходимо для того, чтобы предотвратить разрыв протопластов. Кроме того, в этих условиях тормозится метаболизм и регенерация клеточной стенки. Получение протопластов из каллусных или суспензионных культур осуществляется по той же схеме.

Протопласты можно культивировать различными способами. Применение того или иного метода культивирования зависит от цели эксперимента. Широко используется метод культивирования протопластов в жидких каплях объемом 20–40 мкл при высокой влажности. Суспензию протопластов культивируют также в жидкой среде, наслаивая ее тонким слоем в концентрации в два раза больше, чем оптимальная, на полужидкую питательную среду. Протопласты культивируют на газированной среде, но не поверхностным способом, а заправляя в него.

Условия культивирования протопластов Температура - варьирует в в зависимости от специфики вида. Например, для пшеницы это 22 о С, для другого представителя злаковых – росички кроваво-красной – 30 о С. Обычно протопласты не выдерживают даже незначительного отклонения от оптимальной температуры. Свет высокой интенсивности губительно действует на свежие выделенные протопласты. Оптимальные значения освещенности варьируют в широких пределах. Например, протопласты люцерны образуют колонии в абсолютной темноте, а протопласты немезии оптимально растут при освещенности лк.

В процессе культивирования интактные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало каллусной ткани. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-регенератов. В настоящее время успешно осуществляется регенерация растений из протопластов пасленовых и других культур.

4. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения Особый интерес для человека представляют те биологически активные соединения, которые могут быть использованы в медицине, технике, пищевой и парфюмерной промышленности, сельском хозяйстве. Если для получения ценных БАВ традиционно использовались целые организмы (микроорганизмы, растения, животные), то современная биотехнология нацелена на клеточные технологии, основанные на культивировании свободных и иммобилизованных клеток.

Как альтернативные источники БАВ растительного происхождения клеточные культуры обладают следующими преимуществами: получение экологически чистых продуктов независимо от климата, сезона, погоды; создание клеточных линий- сверхпродуцентов путем генетических манипуляций; сохранение пула генов редких и исчезающих растений-продуцентов; возможность оптимизировать и стандартизировать условия выращивания; возможность автоматизации процессов.

Благодаря усилиям ученых накоплено немало ценной информации о способности культивируемых растительных клеток синтезировать многие традиционные экономически важные продукты: терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, необычные пептиды и специализированные белки, натуральные красители, стероиды, пряности, инсектициды, воски, витамины. Доказана возможность культур клеток осуществлять биотрансформацию, то есть синтезировать некоторые БАВ из дешевых и доступных их предшественников.

В растительном организме синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас зачастую разделены во времени и осуществляются в разных органах растения. Например, алкалоид никотин, который синтезируется в корнях табака, а уже оттуда поступает в листья, где и накапливается. В условиях in vitro все стадии вторичного метаболизма – от синтеза до депонирования – обычно проходят в одной клетке.

Накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений зависит от ряда факторов. Во-первых, выход продукта определяется генотипом донорного растения, правильным выбором его ткани или органа для введения в культуру. Во-вторых, на выход продукта влияет гетерогенность культивируемых клеток по способности к синтезу вторичных метаболитов. В-третьих, в качестве факторов, оказывающих влияние на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений, выступают состав питательной среды и физические условия культивирования.

Важнейшими компонентами питательных сред, эффективно регулирующими и первичный, и вторичный обмен клеток, являются фитогормоны. Увеличение выхода вторичных метаболитов наблюдается при повышении концентрации сахарозы в питательной среде. На накопление вторичных метаболитов могут оказывать источники азота, фосфора и калия. Положительный эффект на биосинтез вторичных веществ оказывают аминокислоты (глутамат, фенилаланин, лейцин, орнитин и др.) и органические кислоты (ацетат, сукцинат, шикимовая и др.).

Следует отметить, что оптимизация состава питательной среды является ключевым условием для повышения выхода продукта. В результате подобных исследований разрабатываются так называемые продукционные среды, на которых культивируемые клетки синтезирую значительное количество вторичных метаболитов.

В настоящее время в разных странах для получения экономически важных веществ используются культуры клеток около ста видов растений, среди которых – женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, амми зубная, мак снотворный и др.