Судебная экспертиза живых лиц Методы иммунохроматографического исследования

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОРФИНА И КОДЕИНА МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ-МАСС- СПЕКТРОМЕТРИИ В ХИМИКО- ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

В настоящее время широкое распространение в химико- токсикологическом она- В настоящее время широкое распространение в химико- токсикологическом она- лизе как высокоспецифичный, чувствительный и достаточно экспрессный метод лизе как высокоспецифичный, чувствительный и достаточно экспрессный метод получила газовая хроматография с масс-селективным детектированием (ГХ/МС). получила газовая хроматография с масс-селективным детектированием (ГХ/МС). По сравнению с прочими хроматографическими методами надежность идентификации наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ существенно повышается по причине использования специфической характеристики вещества масс-спектра, в дополнение к параметрам удерживания, получаемым в хроматографическом процессе [1, 2]. По сравнению с прочими хроматографическими методами надежность идентификации наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ существенно повышается по причине использования специфической характеристики вещества масс-спектра, в дополнение к параметрам удерживания, получаемым в хроматографическом процессе [1, 2]. Морфин и кодеин являются основными оналитами в практике судебно-химической экспертизы и освидетельствовании живых лиц на факт употребления опиатов. При исследованиях крови, учитывая наличие в структуре морфина и кодеина Морфин и кодеин являются основными оналитами в практике судебно-химической экспертизы и освидетельствовании живых лиц на факт употребления опиатов. При исследованиях крови, учитывая наличие в структуре морфина и кодеина полярных гидроксильных групп и их низкие концентрации, наибольшее значение полярных гидроксильных групп и их низкие концентрации, наибольшее значение приобретает онализ в виде дериватов, что позволяет улучшить хроматографическое разделение и увеличить чувствительность. приобретает онализ в виде дериватов, что позволяет улучшить хроматографическое разделение и увеличить чувствительность. Целью настоящего исследования было определение оналитических характеристик методики идентификации морфина и кодеина в крови методом ГХ/МС. Целью настоящего исследования было определение оналитических характеристик методики идентификации морфина и кодеина в крови методом ГХ/МС.

1. Материалы и методы Для исследований использовали трупную кровь лиц, умерших от механических травм (холостые образцы крови). Отобранную кровь замораживали при температуре 18–20С и хранили в замороженном состоянии до начала онализа. Для исследований использовали трупную кровь лиц, умерших от механических травм (холостые образцы крови). Отобранную кровь замораживали при температуре 18–20С и хранили в замороженном состоянии до начала онализа. В качестве стандартных образцов морфина и кодеина использовали их метанольные растворы концентрации 1,0 мг/мл (фирма Radian), рекомендованные производителем для приготовления калибровочных растворов при проведении ГХМС- онализа. В качестве стандартных образцов морфина и кодеина использовали их метанольные растворы концентрации 1,0 мг/мл (фирма Radian), рекомендованные производителем для приготовления калибровочных растворов при проведении ГХМС- онализа. Пробоподготовку образцов крови осуществляли по следующей методике: 2 мл крови помещали в пробирку с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 мл, добавляли 0,5 г натрия тетрабората и выдерживали смесь в течение 5 мин в ультразвуковой ванне. Затем добавляли 8 мл смеси хлороформ н-бутанол (9:1). Смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 мин. Органический экстракт отделяли и пропускали через слой безводного натрия сульфата. Выпаривали органический растворитель в токе воздуха при температуре не более 40С. Пробоподготовку образцов крови осуществляли по следующей методике: 2 мл крови помещали в пробирку с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 мл, добавляли 0,5 г натрия тетрабората и выдерживали смесь в течение 5 мин в ультразвуковой ванне. Затем добавляли 8 мл смеси хлороформ н-бутанол (9:1). Смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 мин. Органический экстракт отделяли и пропускали через слой безводного натрия сульфата. Выпаривали органический растворитель в токе воздуха при температуре не более 40С.

При исследовании на наличие недериватизованных морфина и кодеина сухой остаток экстракта, эквивалентный 2 мл крови, растворяли в 100 мкл этилацетата. При исследовании на наличие недериватизованных морфина и кодеина сухой остаток экстракта, эквивалентный 2 мл крови, растворяли в 100 мкл этилацетата. Методом ГХ/МС онализировали 1–2 мкл пробы. Методом ГХ/МС онализировали 1–2 мкл пробы. Для получения производных (дериватов) морфина и кодеина использовали 2 способа деприватизации: с использованием уксусного ангидрида получение ацетил-производных (Ац- дериватов); и с использованием трифторуксусного ангидрида (ТФА) получение трифторацетил-производных (ТФА- дериватов). Для получения производных (дериватов) морфина и кодеина использовали 2 способа деприватизации: с использованием уксусного ангидрида получение ацетил-производных (Ац- дериватов); и с использованием трифторуксусного ангидрида (ТФА) получение трифторацетил-производных (ТФА- дериватов). Исследование методом ГХ/МС осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890 с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973N с использованием кварцевой капиллярной колонки HP5-MS (5% фенил- диметилсилоксан) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура 170С (выдержка в течение 1 мин), повышение температуры со скоростью 150С/минд о 280С с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя 1 мл/мин в режиме постоянного потока. Температура инжектора 280С, температура оналитического интерфейса 285С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении Исследование методом ГХ/МС осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890 с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973N с использованием кварцевой капиллярной колонки HP5-MS (5% фенил- диметилсилоксан) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура 170С (выдержка в течение 1 мин), повышение температуры со скоростью 150С/минд о 280С с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя 1 мл/мин в режиме постоянного потока. Температура инжектора 280С, температура оналитического интерфейса 285С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении потоков 1:15 (split/splitless); объем пробы 1–2 мкл. потоков 1:15 (split/splitless); объем пробы 1–2 мкл.

Настройку масс-селективного детектора проводили по стандартному веществу перфторбутиламину, вводимому непосредственно в масс-спектрометр; использованный режим настройки Autotune. Настройку масс-селективного детектора проводили по стандартному веществу перфторбутиламину, вводимому непосредственно в масс-спектрометр; использованный режим настройки Autotune. ГХ/МС-онализ исследуемых образцов проводили в режиме сканирования ГХ/МС-онализ исследуемых образцов проводили в режиме сканирования (SCAN), чтобы определить набор характеристических ионов, и в режиме селективного ионного мониторинга (SIM). (SCAN), чтобы определить набор характеристических ионов, и в режиме селективного ионного мониторинга (SIM). ГХ/МС-онализ в режиме сканирования (SCAN). Диапазонм асс сканируемых ионов 39–550 а.е.м. Температуру источника ионов и квадрупольного масс-онализатора устонавливали на уровне 230 и 150С соответственно. Задержка на растворитель, т.е. время включения катода и масс-онализаторачерез 2,5 мин после ввода пробы. Напряжение на умножителе устонавливали на 100 кВ выше напряжения в режиме автоматической настройки Autotune. ГХ/МС-онализ в режиме сканирования (SCAN). Диапазонм асс сканируемых ионов 39–550 а.е.м. Температуру источника ионов и квадрупольного масс-онализатора устонавливали на уровне 230 и 150С соответственно. Задержка на растворитель, т.е. время включения катода и масс-онализаторачерез 2,5 мин после ввода пробы. Напряжение на умножителе устонавливали на 100 кВ выше напряжения в режиме автоматической настройки Autotune. ГХ/МС-онализ в режиме селективного ионного мониторинга (SIM). ГХ/МС-онализ в режиме селективного ионного мониторинга (SIM). Идентификация морфина и кодеина Идентификация морфина и кодеина В режиме SIM регистрировались характеристические ионы онализируемых соединений. В качестве характеристических обязательно выбирали базовый ион масс-спектра и молекулярный ион онализируемого соединения. При отсутствии в масс-спектре интенсивного молекулярного иона в качестве дополнительного к базовому выбирали фрагментарный ион наибольшей интенсивности. В режиме SIM регистрировались характеристические ионы онализируемых соединений. В качестве характеристических обязательно выбирали базовый ион масс-спектра и молекулярный ион онализируемого соединения. При отсутствии в масс-спектре интенсивного молекулярного иона в качестве дополнительного к базовому выбирали фрагментарный ион наибольшей интенсивности. Для идентификации оналитов по масс-спектрам использовали электронные библиотеки масс- спектров NIST, PMW Tox 3, Wiley 275. Для идентификации оналитов по масс-спектрам использовали электронные библиотеки масс- спектров NIST, PMW Tox 3, Wiley 275. Для определения пределов обнаружения морфина и кодеина в образцах крови в виде недериватизованных соединений, а также в виде Ац- и ТФА-дериватов готовили контрольные растворы вышеуказанных оналитов с использованием холостых образцов и стандартных растворов морфина и кодеина. Приготовленные контрольные растворы морфина и кодеина онализировали методом ГХ/МС по вышеописанной методике в порядке возрастания концентраций от 4 до 5 мкг/мл. Для определения пределов обнаружения морфина и кодеина в образцах крови в виде недериватизованных соединений, а также в виде Ац- и ТФА-дериватов готовили контрольные растворы вышеуказанных оналитов с использованием холостых образцов и стандартных растворов морфина и кодеина. Приготовленные контрольные растворы морфина и кодеина онализировали методом ГХ/МС по вышеописанной методике в порядке возрастания концентраций от 4 до 5 мкг/мл. За предел обнаружения принимали минимальную концентрацию контрольного раствора, в котором достоверно обнаруживали целевой оналит по определенному комплексу критериев в зависимости от выбранного режима онализа. За предел обнаружения принимали минимальную концентрацию контрольного раствора, в котором достоверно обнаруживали целевой оналит по определенному комплексу критериев в зависимости от выбранного режима онализа. В режиме SCAN использовали комплекс следующих критериев: совпадение времени удерживания на хроматограмме по полному ионному току (с точностью ±3S. X ) с временем удерживания стандартных образцов; величина коэффициента подобия при оценке масс- спектра, вызванного на вершине хроматографического пика, не менее 90%. В режиме SCAN использовали комплекс следующих критериев: совпадение времени удерживания на хроматограмме по полному ионному току (с точностью ±3S. X ) с временем удерживания стандартных образцов; величина коэффициента подобия при оценке масс- спектра, вызванного на вершине хроматографического пика, не менее 90%. В режиме SIM оценивали совпадение времен удерживания трех характеристических ионов, а также величину ионных отношений (отношение площадей хроматографических пиковхарактеристических ионов), которая должна составлять ±20, 0% от среднего значения ионных отношений, определенных на стандартных образцах морфина и кодеина. В режиме SIM оценивали совпадение времен удерживания трех характеристических ионов, а также величину ионных отношений (отношение площадей хроматографических пиковхарактеристических ионов), которая должна составлять ±20, 0% от среднего значения ионных отношений, определенных на стандартных образцах морфина и кодеина.

2. Результаты и их обсуждение Выбор для исследования хроматографических свойств морфина, кодеина, а Выбор для исследования хроматографических свойств морфина, кодеина, а также их Ац- и ТФА-дериватов неподвижной жидкой фазы 5% фенил-диметилсилоксона (HP5-MS) обусловлен тем, что данная фаза наиболее часто используется в практике химико-токсикологического онализа на наркотические средства и психотропные вещества в лабораториях экспертных учреждений Российской Федерации. также их Ац- и ТФА-дериватов неподвижной жидкой фазы 5% фенил-диметилсилоксона (HP5-MS) обусловлен тем, что данная фаза наиболее часто используется в практике химико-токсикологического онализа на наркотические средства и психотропные вещества в лабораториях экспертных учреждений Российской Федерации. Использованная методика ГХ/МС-онализа рекомендовона Российским центром судебно- медицинской экспертизы для рутинных судебно-химических исследований отравлений опиатами. Использованная методика ГХ/МС-онализа рекомендовона Российским центром судебно- медицинской экспертизы для рутинных судебно-химических исследований отравлений опиатами. Исследование стандартных образцов морфина и кодеина в виде метанольных растворов и в составе контрольных растворов крови показало, что при общем времени онализа, составляющем 14 мин, время удерживания недериватизованных соединений находилось в интервале от 8,00 до 9,00 мин; ТФА-дериватов 7,50–8,50 мин; Ац-дериватов 9,00–11,50 мин. На представленной хроматограмме по полному ионному току экстракта контрольного раствора крови, содержащего морфин и кодеин в концентрации 200 нг/мл при исследовании с дериватизацией уксусным ангидридом, хроматографические пики с временами удерживания 9,70 и 10,67 мин соответствуют морфину-2Ац (диацетилморфину) и кодеину-Ац, остальные многочисленные пики принадлежат веществам оналитического фона крови, среди которых кофеин (5,49 мин), а также компонент полимерных материалов лабораторной Исследование стандартных образцов морфина и кодеина в виде метанольных растворов и в составе контрольных растворов крови показало, что при общем времени онализа, составляющем 14 мин, время удерживания недериватизованных соединений находилось в интервале от 8,00 до 9,00 мин; ТФА-дериватов 7,50–8,50 мин; Ац-дериватов 9,00–11,50 мин. На представленной хроматограмме по полному ионному току экстракта контрольного раствора крови, содержащего морфин и кодеин в концентрации 200 нг/мл при исследовании с дериватизацией уксусным ангидридом, хроматографические пики с временами удерживания 9,70 и 10,67 мин соответствуют морфину-2Ац (диацетилморфину) и кодеину-Ац, остальные многочисленные пики принадлежат веществам оналитического фона крови, среди которых кофеин (5,49 мин), а также компонент полимерных материалов лабораторной посуды диэтилфталат (6,68 мин) посуды диэтилфталат (6,68 мин)

Рис. Хроматограмма по полному ионному току экстракта контрольного раствора крови, содержащего морфин (200 нг/мл) и кодеин (200 нг/мл) при исследовании в виде Ац-дериватов

Заключение Таким образом, в результате проведенных исследований определены времена удерживания морфина, кодеина и их Ац-, ТФА-дериватов на 5% фенил- диметилсилоксане. Показано, что наиболее воспроизводимы результаты ГХ/МС- онализа в виде дериватов по сравнению с недериватизованными опиатами значение коэффициента вариации времени удерживания не превышало 2,0%; установлены величины ионных отношений наиболее интенсивных характеристических ионов масс-спектра. Таким образом, в результате проведенных исследований определены времена удерживания морфина, кодеина и их Ац-, ТФА-дериватов на 5% фенил- диметилсилоксане. Показано, что наиболее воспроизводимы результаты ГХ/МС- онализа в виде дериватов по сравнению с недериватизованными опиатами значение коэффициента вариации времени удерживания не превышало 2,0%; установлены величины ионных отношений наиболее интенсивных характеристических ионов масс-спектра. Пределы обнаружения морфина в крови в недериватизованном виде, в форме Ац- и ТФА-дериватов составили соответственно в режиме сканирования (SCAN), 2400,0, 100,0 и 240,0 нг/мл; в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) 100,0, 20,0 и 10,0 нг/мл; оналогичные показатели для кодеина составили: 200,0, 100,0 и 100,0 нг/мл, а также 40,0, 14,0 и 10,0 нг/мл. Пределы обнаружения морфина в крови в недериватизованном виде, в форме Ац- и ТФА-дериватов составили соответственно в режиме сканирования (SCAN), 2400,0, 100,0 и 240,0 нг/мл; в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) 100,0, 20,0 и 10,0 нг/мл; оналогичные показатели для кодеина составили: 200,0, 100,0 и 100,0 нг/мл, а также 40,0, 14,0 и 10,0 нг/мл. Дериватизация морфина и кодеина уксусным и трифторуксусным ангидридами позволяет обнаруживать их на уровне терапевтических концентраций и использовать данный вариант пробоподготовки в ГХ/МС-онализе при проведении судебно-химической экспертизы и освидетельствовании живых лиц по факту немедицинского применения опиатов. Дериватизация морфина и кодеина уксусным и трифторуксусным ангидридами позволяет обнаруживать их на уровне терапевтических концентраций и использовать данный вариант пробоподготовки в ГХ/МС-онализе при проведении судебно-химической экспертизы и освидетельствовании живых лиц по факту немедицинского применения опиатов.

Литература [1] Еремин, С.К. Анализ наркотических средств / С.К.Еремин, Б.Н.Изотов, [1] Еремин, С.К. Анализ наркотических средств / С.К.Еремин, Б.Н.Изотов, Н.В. Веселовская. – М.: Мысль, – 25 с. Н.В. Веселовская. – М.: Мысль, – 25 с. [2] Maurer, H.H. Systematic toxicology analysis of drugs and their metabolites by gas [2] Maurer, H.H. Systematic toxicology analysis of drugs and their metabolites by gas chromatography-mass spectrometry / H.H.Maurer // J. Chromatogr. – – chromatography-mass spectrometry / H.H.Maurer // J. Chromatogr. – – V – P. 3–41. V – P. 3–41. [3] Мелентьев, А.Б. Определение морфина и кодеина в крови в виде их [3] Мелентьев, А.Б. Определение морфина и кодеина в крови в виде их пропионовых эфиров методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии / пропионовых эфиров методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии / А.Б.Мелентьев // Журн. оналит. химии. – – Т. 59. – 6. – С. 637–641. А.Б.Мелентьев // Журн. оналит. химии. – – Т. 59. – 6. – С. 637–641. [4] Дериватизация в ГХ/МС-онализе лекарственных и наркотических веществ, [4] Дериватизация в ГХ/МС-онализе лекарственных и наркотических веществ, имеющих токсикологическое значение: матер. к сем-ру судеб.-мед. экспер- имеющих токсикологическое значение: матер. к сем-ру судеб.-мед. экспер- тов. – М.: Рос. Центр судеб.-мед. экспертизы; Бюро судеб.-мед. экспертизы тов. – М.: Рос. Центр судеб.-мед. экспертизы; Бюро судеб.-мед. экспертизы МЗ МО., – 86 с. МЗ МО., – 86 с. [5] Мелентьев, А.Б. Практическое руководство по скринингу лекарственных, [5] Мелентьев, А.Б. Практическое руководство по скринингу лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов методом газовой хроматогра- наркотических веществ и их метаболитов методом газовой хроматогра- фии с масс-селективным детектором для целей судебной токсикологии / фии с масс-селективным детектором для целей судебной токсикологии / А.Б.Мелентьев. – Челябинск, – Ч. 1. – 62 с. А.Б.Мелентьев. – Челябинск, – Ч. 1. – 62 с. [6] Симонов, Е.А. Наркотики: методы онализа на коже, в ее придатках и выде- [6] Симонов, Е.А. Наркотики: методы онализа на коже, в ее придатках и выде- лениях / Е.А. Симонов, Б.Н. Изотов, А.В.Фесенко. – М.: Анахарсис, – лениях / Е.А. Симонов, Б.Н. Изотов, А.В.Фесенко. – М.: Анахарсис, – 130 с. 130 с. [7] Обнаружение морфина, кодеина и диацетилморфина (героина) при судебно- [7] Обнаружение морфина, кодеина и диацетилморфина (героина) при судебно- химическом исследовании трупной крови: пособие для врачей судеб.-мед. экс- химическом исследовании трупной крови: пособие для врачей судеб.-мед. экс- пертов-химиков / Е.М.Саломатин[ и др.]. – М., – 35 с. пертов-химиков / Е.М.Саломатин[ и др.]. – М., – 35 с. [8] Вершинин, В.И. Компьютерная идентификация органических соединений / [8] Вершинин, В.И. Компьютерная идентификация органических соединений / В.И. Вершинин, Б.Г.Дерендяев, К.С.Лебедев. – М.: Академкнига, – В.И. Вершинин, Б.Г.Дерендяев, К.С.Лебедев. – М.: Академкнига, – 197 с. 197 с.

Тест-полоски «иммунохром» предназначены для одноэтапного быстрого качественного определения морфина, амфетамина (и их метаболитов) в моче человека методом иммунохроматографического онализа. предназначены для одноэтапного быстрого качественного определения морфина, амфетамина (и их метаболитов) в моче человека методом иммунохроматографического онализа.

Принцип работы Определение основано на принципе иммунохроматографического онализа, при котором наркотик (и его метаболиты), находящийся в онализируемом образце мочи, конкурирует с наркотиком (и его метаболитами), иммобилизованным на пористой мембране иммунохроматографической полоски за ограниченное количество антител.

Испытуемый образец мочи всасывается поглощающими участками полоски и в случае наличия в образце наркотика (или его метаболитов) - «антиген», он вступает в реакцию со специфическими моноклональными антителами к наркотику, связанными с частицами коллоидного золота, образуя комплекс «антиген-антитело». Испытуемый образец мочи всасывается поглощающими участками полоски и в случае наличия в образце наркотика (или его метаболитов) - «антиген», он вступает в реакцию со специфическими моноклональными антителами к наркотику, связанными с частицами коллоидного золота, образуя комплекс «антиген-антитело».

Этот комплекс не вступает в реакцию конкурентного связывания с антигеном, иммобилизованным в тестовой зоне полоски, при этом полоса розового цвета в тестовой зоне не выявляется. Наличие одной полосы розового цвета в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация наркотика (или его метаболитов) в исследуемом образце мочи составляет определенное количество вещества или выше. Выявление двух параллельных полос розового цвета (в тестовой и контрольной зонах полоски) свидетельствует о том, что в исследуемом образце мочи наркотик (или его метаболиты) отсутствуют или же их концентрация ниже этого количества.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Морфин Чувствительность определения (минимально определяемая концентрация) составляет нг/мл морфина (или его метаболитов). Время проведения онализа - 5 минут. Время проведения онализа - 5 минут. Каждая полоска предназначена для одного определения наличия морфина (или его метаболитов) в моче человека. Полоска используется только для качественного определения морфина (или его метаболитов) и не предназначена для количественного определения морфина в моче, или степени опьянения. Амфетамин Чувствительность определения (минимально определяемая концентрация) составляет нг/мл амфетамина (или его метаболитов). Время проведения онализа - 5 минут. Каждая полоска предназначена для одного определения наличия амфетамина (или его метаболитов) в моче человека. Полоска используется только для качественного определения амфетамина (или его метаболитов) и не предназначена для количественного определения амфетамина в моче или степени опьянения.

Для проведения онализа, кроме тест-полосок, необходимо: секундомер; пластмассовые или стеклянные стаканчики, вместимостью мл.

Анализируемые образцы Мочу собирают в чистую, сухую стеклянную или пластиковую посуду (без консервантов). Для онализа следует использовать только прозрачные образцы. Примеси, типа отбеливателей или другие оксидирующие агенты, добавляемые в образцы мочи, могут давать ошибочные результаты тестирования независимо от используемого метода онализа. Если предполагается фальсификация, повторите онализ с другим образцом мочи. Мочу собирают в чистую, сухую стеклянную или пластиковую посуду (без консервантов). Для онализа следует использовать только прозрачные образцы. Примеси, типа отбеливателей или другие оксидирующие агенты, добавляемые в образцы мочи, могут давать ошибочные результаты тестирования независимо от используемого метода онализа. Если предполагается фальсификация, повторите онализ с другим образцом мочи.

Проведение онализа Образцы мочи и полоска перед проведением онализа должны быть доведены до комнатной температуры ( °С). Т. е. образцы мочи и компоненты полоски должны выдерживаться при комнатной температуре до начала проведения онализа не менее 5 минут. В чистую сухую емкость поместить онализируемый образец мочи человека (уровень её не должен превышать 1-1,5 см. Вскрыть упаковку полоски, разрывая ее вдоль прорези, извлечь полоску и погрузить её вертикально концом со стрелками в мочу до уровня ограничительной линии на сек. Извлечь полоску из мочи, положить её на ровную, чистую, сухую поверхность и через 5 минут визуально оценить результат реакции.