ТЕМА: Ферментационные процессы

2 1Биореакторы 2 Конструкция биореакторов 3Специализированные ферментационные процессы

3 При ферментационной технологии можно использовать цельные живые клетки (микроорганизмы, клетки животных или растений) или клеточные компоненты с целью физиче­ских или химических преобразований органических веществ. Однако не­ достаточно получать требуемые изменения веществ, метод должен иметь преимущества перед другими, применяемыми в настоящее время техно­логиями производства этих же самых продуктов.

4 Преимущества производства органических продуктов биотехноло­гическими способами перед чисто химическими методами достаточно многогранны: Многие сложные органические молекулы, такие, как белки и антибио­тики, не могут практически быть синтезированы химическими спосо­бамии. Биоконверсия обеспечивает значительно больший выход целевого про­дукта. Биологические системы функционируют при более низких температу­рах, близких к нейтральному значениях рН и т. п. Биологические реакции намного специфичнее, чем ре­ акции химического катализа. Биологические процессы обеспечивают почти исключительно продук­цию чистых изомеров одного типа, а не их смесей, как это часто бывает в реакциях химического синтеза.

5 Но вместе с тем биологические способы в сравнении с химическими методами обладают рядом явных недостатков: Биологические системы могут легко быть загрязнены посторон­ней нежелательной микрофлорой. Целевой продукт, синтезируемый биологическим способом, при­сутствует в довольно сложной смеси, что обусловливает необхо­димость разделения его от примеси ненужных веществ. Биотехнологические производства требуют больших количеств воды, которую в итоге необходимо удалять, сбрасывая в окру­жающую среду. Биопроцессы обычно идут медленнее в сравнении со стандартны­ми химическими процессами.

6 Для каждого биотехнологического процесса должна быть разрабо­тана подходящая схема, а сам процесс должен постоянно наблюдаться и тщательно контролироваться. Для большинства практических биотехно­логических процессов такими системами являются ферментеры или био­реакторы, которые обеспечивают необходимые физические условия, способствующие наилучшему взаимодействию катализатора со средой и поставляемым материалом.

1 Биореакторы Основное требование к биореакторам любого типа сводится к обес­печению оптимальных условий роста продуцента или накоплению син­тезируемого им продукта. Для достижения указанных целей необходимо разрабатывать технологию, призванную оптимизировать процесс, а именно: использовать подходящий источник энергии, набор питательных веществ должен соответствовать питательным потребностям организма-продуцента, из ростовой среды должны быть удалены соединения, ингибирующие его жизнедеятельность, должна быть подобрана соответст­вующая посевная доза и, наконец, обеспечены все остальные требуемые физико- химические условия. 7

Экономически рентабельные процессы в своей основе весьма сходны, независимо от избранного продуцента, ис­пользуемой среды и образуемого продукта. Фак­тически один и тот же биореактор (лишь с небольшими изменениями) может быть использован для производства ферментов, антибиотиков, ор­ ганических кислот или одноклеточного белка. 8

Биотехнологические процессы отличаются от про­ цессов химического синтеза и могут быть двух типов: периодическими и непрерывными. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает доволь­но существенное влияние на процессы массообмена (обмена веществ между различными фазами - перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами). Поэтому одним из важнейших механизмов биореакторов является система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате. 9

Другим существенным различием между биотехнологическими и химическими процессами является необходимость создания аэробных или анаэробных условий, требуемых для культивирования соответствующего организма. Поэтому в определенных случаях необходимо пода­вать кислород и удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую очередь двуокись углерода (СО 2 ). Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны обеспечить баланс между расходом О 2 и его по­ступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не одинакова на различных стадиях культивирования. 10

Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в биореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры. Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ). Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения. 11

Специфическим элементом биореактора является система, обеспе­чивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания. Таким образом, процессам стерилизации в биотехнологическом производстве отводится важное место. 12

В последнее время в биотехнологию внедряется принцип дифференцирования режимов культивирования: разные этапы одного и того же процесса осуществляются при различных условиях - температура, рН, аэрация и т. п. Естественно, это создает новые (дополнительные) требо­вания при конструировании реакторов. Таким образом, в соответствии с основными принципами реализации биотехнологических процессов со­временные биореакторы должны обладать следующими системами: 13

эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания; обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонен­тов системы (аэрирование в первую очередь); теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температу­ры внутри реактора и ее контролируемые изменения; пеногашения; стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры; контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов. 14

При разработке новых биотехнологических процессов сначала прибегают к периодическому культивированию. Периодическое культивирование включает несколько этапов: стерилизацию сред и оборудования, загрузку биореактора питательной средой, внесение посевного материала, выращивание культуры, отделение и очистку готового продукта. После окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу. 15

При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на несколько фаз: 1) После введения инокулята обычно наблюдают индукцион­ный период (лаг-фаза) (1), в течение которого не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образо­вания каких-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка. 2) Индукционный период сменяется фазой экспоненциального роста (2), в течение которой быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой. 16

3) В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Как правило, она переходит в фазу линейного роста (3), характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры. В этой фазе уже имеет место от­клонение точек в сторону меньших значений количества клеток или продуктов, что служит эксперимен­тальным критерием пе­рехода культуры в ли­нейную фазу роста. 4) Фаза линейного ро­ста может смениться весьманепродол­жительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста(4). 5) В некоторых случа­ях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую и продолжительную стационарную фазу (5). 17

В этих условиях культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим характеризуется достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток. 6) Если система полностью истощается по субстрату или накопление ингибирующих рост продуктов является значитель­ ным, то скорость прироста биомассы становится равной нулю, происходят существенные физиологические изменения клеток и, как правило, наблюдается фаза отмирания культуры (6). 18

19 Рис. 1. Типичная кинетическая кривая роста популяции микроорганизмов: 1- индукционный период; 2- фаза экспоненциаль­ного роста; 3 - фаза линейного роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза отмирания культуры

Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспо­ненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так назы­ ваемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (анти­биотики, пигменты и т. п. - так называемые вторичные метаболиты). Довольно широко в биотехнологии используется периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесе­ния питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивиро­ вания в аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества либо порциями, либо непрерывно "по каплям". 20

Существует также отъемной-поливочное культивирование, когда часть содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регу­лярное "омолаживание" культуры и задерживает ее переход в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным культивированием. Модификацией периодического культивирования является культи­вирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно по­ступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к сниже­ нию концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса кон­центрированную биомассу. 21

В непрерывных процессах культивирования клетки постоянно под­держиваются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор подается свежая питательная среда и обеспечивается отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результа­те разбавления содержимого свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования. 22

При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая сис­тема возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступ­ление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижает­ся концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и ско­ рость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начина­ет активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможе­нию роста культуры. Конечным итогом этих процессов является (после серии затухающих колебаний) установление равновесия между скоро­стью роста культуры и ее разбавлением. 23

Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Его конструкция предусматривает наличие: 1) приспособления для подачи питательной среды; 2) устройства, обес­печивающего отток культуральной жидкости вместе с клетками, и 3) сис­темы, контролирующей концентрацию элементов питательной среды и управляющей скоростью подачи питательной среды. Последнее является наиболее важным и наиболее сложно осущест­вимым устройством. 24

Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространенным методом ее определения является измерение светорассеивания с помощью фото­элементов. Повышение концентрации клеток и соответственно оптиче­ской плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот. По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь систе­мами контроля скорости протока. 25

Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малым протоком, когда концентрация клеток изменяется незначительно с изме­нением скорости протока, что облегчает саморегулировку системы. Турбидостаты используются в процессах, характеризующихся высокой скоростью разбавления при быстром и резком изменении концентрации биомассы. 26

2 Конструкция биореакторов Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии: 1. Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранение требуемой микрофлоры. 2. Объем культивируемой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого. 27

3. Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных орга­низмов. 4. Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться. 5. Культура при выращивании должна хорошо перемеши­ваться. 28

К материалам, используемым при конструировании сложных биореакторов, предъявляются определенные тре­бования: а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающими­ся в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения метал­лами даже в следовых количествах; б) материалы должны быть нетоксичными, чтобы даже при самой малой растворимости они не ингибировали рост культуры; 29

в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать по­вторную стерилизацию паром под давлением; г) перемешивающая система биореактора и места поступления и вы­хода материалов и продуктов должны быть легко доступными и доста­точно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механи­ческих воздействиях; д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными. 30

Для оптимизации биотехнологических процессов требуется постоянный и тщательный контроль за изменяющейся картиной ферментации, что обеспечивается наличием в биореакторах соответствующих датчи­ков, позволяющих осуществлять избирательный анализ определенных параметров ферментационного процесса. Неотъемлемой частью боль­шинства ферментаций является та или иная степень компьютеризации. Важным классификационным принципом биореакторов различного типа являются системы перемешивания. По способу перемешивания и аэрации биореакторы под­разделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуля­ ционным перемешиванием. 31

Наиболее распростра­ненные конструкции в современной микробиологической промышлен­ности - аппараты с механическим перемешиванием 32

16 Схема устройства биореактора с механическим перемешиванием 1- Крышка люка. 2 - Мешалка. 3 - Крыльчатка. 4 - Отражательная перегородка. 5 - Выход воздуха Окно для наблюдения Стерильные соединения Ввод пробы Муфта для рН электрода Карман для термометра Сливной кран (для ферментеров емкостью более 2000 литров) Двойная рубашка Сочленения для пара и охлаждающей воды Слив. Наиболее распростра­ ненные конструкции в современной микробиоло- гической промышлен­ности - аппараты с механическим перемешиванием

Биогазовая установка для пищевых и твердых отходов 34 $

Биореактор для получения биогаза на Гомельской птицеферме 35

Такие реакторы имеют механическую мешалку с центральным валом и лопастями (лопатками), число которых обычно равно 6, реже 8. Лопасти могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные пе­ регородки - узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутрен­ним стенкам биореактора. Они предотвращают возникновение водоворо­тов и обеспечивают вихревое движение жидкости, равномерно распреде­ляемое но всему объему реактора. 36

Аэрация может осущест­вляться также путем барботажа - подачи воздуха снизу через горизонтальную трубку с отверстиями, иногда аэрирование достигается применением специальных вибраторов, которые обеспечивают высокую степень асеп­тики, малый расход энергии и относительно слабо травмируют клетки. В аппаратах с пневматическим перемешиванием мешалка отсутствует, и перемешивание жидкости осуществляется пузырьками газа. Естественно, что скорость массообмена в них намного ниже, чем в ферментерах с механическим перемешиванием. 37

Классическим аппаратом такого типа является эрлифтный реактор (air lift - подъем воздуха). Биореакторы с пневматическим перемешива­нием характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содер­жимого и получили распространение при выращивании клеток животных и растений. 38

Биореакторы циркуляционного типа осна­щены насосами и эжекторами, создающими направленный ток жидкости по замкнутому контуру (кругу). Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем самым культуральная среда одновременно с перемешиванием может насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использова­нием специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти биореакторы отличаются простотой конструкции и надежностью в эксплуатации. 39

В последнее время разрабатываются новые способы аэрации. Например, воздух может подаваться через специальные полипропиленовые мембраны. Это позволяет избегать пенообразования, и очень хорошо зарекомендовало себя при выращивании клеток эукариотических организмов, в частности при промышленном получении интерферона. 40

Теплообмен в биореакторах осуществляется с помощью труб с охлаждающим или нагревающим агентом, которые оплетают аппарат и образуют так называемую рубашку реактора. Иногда эта система труб располагается непосредственно в полости ферментера. Нагревающими агентами в промышленных биореакторах служат горячая вода или пар, в лабораторных ферментерах чаще используется электрический подогрев. 41

Система пеногашения биореактора – это средство борьбы с избыточным пенообразованием. Существуют химические, механические, акустические и другие виды пеногашения. Наиболее часто применяют химические и механические способы. К химическим средствам пеногашения относятся поверхностно активные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей, становятся центрами их неустойчивости. Эффективными пеногасителями служат растительные масла и животные жиры. Недостатком этих пеногасителей является то, что при их утилизации микробными клетками сами по себе способствуют пенообразованию. 42

Механические пеногасители представляют собой различные устрой­ства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое. Устройства и режим стерилизации определяется конструкцией био­реактора, вспомогательного оборудования, используемых питательных сред и т. п. Наибольшее значение имеют термический метод стерилиза­ции оборудования и сред и фильтрационный способ, применяемый для удаления микроорганизмов из подаваемого в ферментеры воздуха или другого газа. 43

Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных ус­ тановках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной каме­ры: 0,5-100 л (лабораторные), л (лабораторно-промышленные) и л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба фер­ментации решаются конкретные задачи отработки (на­лаживания) производства и его оптимизации. 44

С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи: 1) кинетические - определение скорости роста клеток, эффектив­ности утилизации субстратов и образования целевого продукта; 2) некоторые массообменные - расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О 2 и других газов, скорость освобож­дения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО 2 ); 3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируе­мые субстраты и О 2 с получаемыми целевым и побочными продуктами. 45

Лабораторно-промышленные установки используют для поиска наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирования промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются приме­ нять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промыш­ленном масштабе. 46

Лабораторный биореактор

Биореактор для выращивания водорослей

Биореактор для переработки навоза

Мобильная биогазовая установка Шведского института сельского хозяйства и экологической инженерии 53

3 Специализированные ферментационные процессы Большинство ферментационных технологий связано с жидкими аэрируемыми системами, однако в настоящее время достаточно широко используются ферментационные технологии, основанные на утилизации плотных субстратов, при отсутствии воды или малом ее количестве, а также в безкислородных условиях. Существуют процессы, в ко­торых роль жидкой фазы сведена до минимума: она, используется лишь для увлажнения твердой поверхности или воздуха (газа). В зависимости от превалирующей фазы процессы и соответствующие им аппараты под­ разделяются на твердофазные и газофазные. 54

Твердофазные осуществляются, как правило, на основе растительного сырья и используют чаще всего мицелиальные грибы или дрожжи. Различают три типа твердофазных процессов: а) Поверхностные, когда слой субстрата не превышает 3-7 см. В качестве "биореакторов" используются большие (до не­скольких квадратных метров) подносы или культуральные камеры. б) Глубинные процессы, идущие в не перемешиваемом слое. Биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных твердофазных процессов разработаны ариспособле- (ия. обеспечивающие диффузионный и конвекционный газообмен. 55

в) Перемешиваемые процессы, протекающие в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, который может быть гомогенным (полужидкой консистенции) или состоять из частиц твердого вещества, взвешенных в жидкости (переходный вариант от твердофазного процесса к процессу в жидкой фазе). Для этого обычно используют биореакторы с низкоскоростным перемешиванием. 56

Интерес к твердофазным процессам обусловлен некоторыми их преимуществами по сравнению с процессами, осуществляющимися в жил­ой фазе: они требуют меньших затрат на оснащение и более дешевые в эксплуатации; характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта; низкое содержание воды препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой; твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую Среду больших количеств сточных вод. 57

Однако, и в данных процессах есть некоторые недостатки. Так, вследствие отсутствия хорошего перемешивания, продуцент часто растет в виде колоний и лишь постепенно может распространяться по субстрату. При этом возникает локальная недостача питательных веществ и часть субстрата вообще не используется продуцентом. В аппаратах с твердым наполнителем, через который пропускают газ, происходят газофазные процессы. В таких аппаратах получают, например, спирт на основе дрожжей. Газ, покидающий аппарат, не­сет с собой летучие продукты жизнедеятельности дрожжей (в том числе и спирт), которые конденсируются в холодильнике. 58

59 Лекция закончена !