Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ при тестировании подростков в Псковской области Никитина Наталья Михайловна врач-лаборант ГБУЗ «Наркологический диспансер Псковской области»

Разработка новых методических подходов в химико-токсикологическом анализе различных биологических объектов, в том числе волос и срезов ногтевых пластин, и оценка возможности их использования в тестировании подростков на содержание наркотических и психотропных веществ. Цель работы. Разработка новых методических подходов в химико-токсикологическом анализе различных биологических объектов, в том числе волос и срезов ногтевых пластин, и оценка возможности их использования в тестировании подростков на содержание наркотических и психотропных веществ. Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ при тестировании подростков в Псковской области

Научная новизна: 1. Предложен новый подход в методике пробоподготовки мочи и крови для скринингового ГХ-МС анализа, обеспечивающий достоверность идентификации наркотических и психоактивных веществ, а также охват максимально бòльшего спектра анализируемых соединений, и особенно летучих компонентов пробы, за счет совмещения технологических операций при пробоподготовке, а также сокращении времени проведения анализа и уменьшении расхода реагентов необходимых для проведения анализа. 2. Предложено и обосновано использование двойной экстракции кератиновых структур. 3. Предложен новый алгоритм аналитических процедур для обнаружения в сложных матрицах веществ кислотного, нейтрального, слабоосновного и основного характера, используя минимальное количество биоматериала. Следуя данному алгоритму, весь анализ заключается в проведении всего двух процедур: хромато-масс- спектрометрический анализ в режиме сканирования по характеристическим ионам для обнаружения каннабиноидов и ГХ-МС скрининг на основные наркотические и психотропные вещества в режиме сканирования по полному ионному току. 4. Исследованы методы изолирования анализов из кератиновых структур и предложены к использованию новые варианты, в частности использование ферментов трипсин, пепсин, папаин и кератина за. 5. Изучены способы проведения тестирования подростков. Разработан алгоритм процедуры тестирования, наиболее комфортный для всех участников. 6. Предложено использование скринингового ГХ-МС анализа при организации массовых и оперативных обследований, например при контроле подростков на употребление наркотиков

Химико-токсикологическая лаборатория Псковской области

Тестирование проводилось в гг. общеобразовательные школы г. Пскова и области вечерние школы профтехучилища высшие учебные заведения По результатам первого года тестирования наиболее удобным был выбран вариант проведения процедуры тестирования с выездом бригады в учебные заведения. Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ при тестировании подростков в Псковской области

Вся процедура непосредственно тестирования организована в соответствии с Приказом МЗиСР РФ 40 от 2006 г. и включает в себя следующие операции: 1) пробоотбор, 2) исследования мочи на предмет фальсификации, 3) предварительные исследования с использованием групповых методов анализа на наркотические и лекарственные вещества (ИХА), 4) подтверждающие исследования методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием – при получении положительных результатов. Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ при тестировании подростков в Псковской области

В процессе работы были выявлены следующие варианты фальсификаций: 1) Подмена мочи. 2) Разбавление образца мочи. 3) Концентрирование мочи 4) Употребление продуктов, содержащих аскорбиновую кислоту 5) Добавление инородных веществ в образец мочи. При проведении тестов на фальсификацию мочи необходимо учитывать возрастные физиологические особенности молодого организма. Так, при не полностью сформировавшейся функции клеточных мембран у подростков возможно обнаружение белка в моче после физических нагрузок. Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ при тестировании подростков в Псковской области

Сравнительный анализ результатов тестирования подростков Псковской области

Проведение скрининговых исследований методом иммунохроматографии (ИХА) Преимущества: Простота метода (нет необходимости в дополнительных реагентах и приборах, все необходимые иммунореагенты для анализа нанесены заранее на мембрану). Определение может быть проведено неподготовленным персоналом в нелабораторных условиях. Быстрота метода. Визуальная детекция результатов для качественного или полуколичественного анализа Недостатки: не селективность метода (групповые реакции) чувствительность к изменениям биохимических показателей мочи (несрабатывание тест-полосок, получение ложноотрицательных результатов) кросс-реактивность (получение ложноположительных результатов) ограниченное количество анализов, на которые разработаны наборы

Необходимость разработки скрининговых методов анализа на основе экспертных подтверждающих физико-химических методов вызвана многообразием химических соединений, которые при определенных обстоятельствах могут стать источником одурманивания и отравлений. Круг этих веществ постоянно расширяется по мере синтеза новых соединений. Комбинированный метод – хромато-масс-спектрометрия – рассматривается как два раздельных метода, дающего возможность использовать его не только в качестве скринингового, но и экспертного подтверждающего. С помощью хроматографии происходит разделение смеси на отдельные компоненты. С помощью масс-спектрометрии проводят обнаружение и количественное определение разделенных веществ смеси. Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ при тестировании подростков в Псковской области

Случаи, подтверждающие необходимость пересмотра существующего алгоритма проведения тестирования Случай 1. Синтетические каннабимиметики Cилильное производное метаболита синтетического каннабимиметика РВ22F на хроматограмме, снятой в режиме полного сканирования, идентифицированное по характеристическим ионам. Время удерживания метаболита – мин и его масс-спектр

Случаи, подтверждающие необходимость пересмотра существующего алгоритма проведения тестирования Случай 2. Баклофен Хроматограмма, снятая в режиме полного сканирования, и производное баклофена на ней, идентифицированное по характеристическим ионам. Время удерживания баклофена – 10.4 мин и его масс-спектр

Случаи, подтверждающие необходимость пересмотра существующего алгоритма проведения тестирования Случай 3. Дицикломин (триган-Д) Хроматограмма мочи, снятая в режиме полного сканирования, после употребления таблеток «Триган Д». Время удерживания парацетамола – 10.2, дицикломина – Масс-спектр дицикломина

Аппаратура ГХ-МС. Agilent 7820/5975 с колонкой НР-5MS. Условия анализа: газ-носитель гелий, скорость потока через колонку 2 мл/мин. Программа: 50 0 С(0.5 мин) 99 0 С /мин С (1 мин) 15 0 С/мин С Объем вводимой пробы - 1,0 мкл Оптимизация пробоподготовки мочи и крови для скринингового ГХ-МС анализа бутилацетат Карбонатный буфер виола 2 мл Хлорид натрия Внутренний стандарт Исследуемый образец (моча, кровь) экстракция центрифугирование Закол в ГХ-МС

Двойная экстракция волос и срезов ногтевых пластин для скринингового ГХ-МС анализа биообъект метанолNaOH 5 н биообъект экстракция Гидролиз (40 0 С ночь) Закол в ГХ-МС центрифугирование Твердофазная экстракция II I

I а)б) в)г) Рис. а) Хроматограмма метанольного экстракта пробы волос (SCAN). Пик с временем удерживания мин соответствует каннабидиолу, Δ9-тетрагидроканнабинолу (ТНС), 15.9 – каннабинолу. Вещества идентифицированы по времени удерживания и по масс-спектрам; б) Масс-спектр каннабидиола; в) Масс-спектр ТНС; г) Масс-спектр каннабиола.

II I Рис. Хроматограмма щелочного экстракта волос, снятая в режиме сканирования по характеристическим ионам (SIM) по короткой программе. Пик с временем удерживания 8.19 мин соответствует каннабидиолу, Δ9-тетрагидроканнабинолу (ТНС), 9.63 – каннабинолу.

1. На основании проведенных исследований разработан новый подход в методике пробоподготовки мочи и крови для скринингового ГХ-МС анализа, обеспечивающий высокую точность и достоверность распознавания и определения наркотических и психоактивных веществ, а также охват максимально бòльшего спектра анализируемых соединений, и особенно летучих компонентов пробы, за счет совмещения технологических операций при пробоподготовке, а также сокращении времени проведения анализа и уменьшении расхода реагентов необходимых для проведения анализа. 2. На основании экспериментальных данных была разработана методика пробоподготовки кератиновых структур - двойная экстракция. 3. Разработан новый алгоритм аналитических процедур для обнаружения в сложных матрицах веществ кислотного, нейтрального, слабоосновного и основного характера, используя минимальное количество биоматериала. Следуя данному алгоритму, весь анализ заключается в проведении всего двух процедур: хромато масс-спектрометрический анализ в режиме сканирования по характеристическим ионам для обнаружения каннабиноидов и хромато масс- спектрометрический скрининг на основные наркотические и психотропные вещества в режиме сканирования по полному ионному току. 4. Предложены к использованию новые варианты оптимизации процесса пробоподготовки волос и ногтей, в частности использование ферментов для гидролиза - трипсина, пепсина и кератин азы. 5. Разработан алгоритм процедуры тестирования подростков при использовании скринингового ГХ-МС, который может быть введен в рутинную практику химико- токсикологических лабораторий. Выводы 1. На основании проведенных исследований разработан новый подход в методике пробоподготовки мочи и крови для скринингового ГХ-МС анализа, обеспечивающий высокую точность и достоверность распознавания и определения наркотических и психоактивных веществ, а также охват максимально бòльшего спектра анализируемых соединений, и особенно летучих компонентов пробы, за счет совмещения технологических операций при пробоподготовке, а также сокращении времени проведения анализа и уменьшении расхода реагентов необходимых для проведения анализа. 2. На основании экспериментальных данных была разработана методика пробоподготовки кератиновых структур - двойная экстракция. 3. Разработан новый алгоритм аналитических процедур для обнаружения в сложных матрицах веществ кислотного, нейтрального, слабоосновного и основного характера, используя минимальное количество биоматериала. Следуя данному алгоритму, весь анализ заключается в проведении всего двух процедур: хромато масс-спектрометрический анализ в режиме сканирования по характеристическим ионам для обнаружения каннабиноидов и хромато масс- спектрометрический скрининг на основные наркотические и психотропные вещества в режиме сканирования по полному ионному току. 4. Предложены к использованию новые варианты оптимизации процесса пробоподготовки волос и ногтей, в частности использование ферментов для гидролиза - трипсина, пепсина и кератин азы. 5. Разработан алгоритм процедуры тестирования подростков при использовании скринингового ГХ-МС, который может быть введен в рутинную практику химико- токсикологических лабораторий.

Публикации. По материалам дипломной работы опубликовано 7 статей, из них 6 в журнале «Наркология» разных годов издания, рецензируемом ВАК, и 13 тезисов докладов.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !