Методы определения активности антибиотиков и чувствительности к ним микроорганизмов. Кафедра лабораторной диагностики ИПО БГМУ Цветкова А.В.

Определение антибиотикорезистентности Задачи проведения исследований по оценке антибиотикорезистентности: 1. Обоснование назначения оптимальной индивидуальной антибиотикотерапии у конкретного больного. 2. Обоснование эмпирической антибиотикотерапии на основании данных эпидемиологического мониторинга за уровнем антибиотикорезистентности м/о, циркулирующих в конкретных регионах или учреждениях

Определение антибиотикорезистентности Этапы проведения исследований: 1. Оценка целесообразности изучения антибиотикорезистентности выделенного м/о 2. Выбор антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование. 3. Выбор методов проведения исследования и контроля качества. 4. Интерпретация результатов исследования и выдача рекомендаций по лечению.

Определение антибиотикорезистентности 1 этап. Показания для проведения исследований: Если уровень устойчивости м/о к антибактериальным препаратам не может быть предсказан на основании данных идентификации. Все м/о, выделенные из стерильных локусов. Если выделенный м/о относится к таксономической группе, для которой характерна высокая частота распространения приобретенной устойчивости.

Определение антибиотикорезистентности 2 этап. Выбор антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование. На основе данных о природной устойчивости м/о и клинической эффективности антибиотиков. С учетом фармакокинетических, токсикологических параметров препарата. С учетом локализации и тяжести инфекции.

Определение антибиотикорезистетности 3 этап. Выбор методов проведения исследования и контроля качества Влияют: Точность Воспроизводимость Трудоемкость стоимость

Определение антибиотикорезистентности 3 этап. Выбор методов проведения исследования и контроля качества. Методы Диффу- зионные Диско- диффузионный Е-тест Серийных разведений Макрометод Микрометод

Определение антибиотикорезистентности Методические указания МУК «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»

Определение антибиотикорезистентности. Метод серийных разведений. Основан на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибиотика- величины минимальной подавляющей концентрации (МПК). МПК- минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма.

Определение антибиотикорезистентности. Метод серийных разведений. В зависимости от характера питательной среды различают метод серийных разведений в агаре в бульоне В зависимости от объема используемой питательной среды: Макрометод Микрометод

Определение антибиотикорезистентности. Метод серийных разведений. Этапы: 1. Приготовление растворов антибиотиков (а/б) 2. Приготовление ПС с растворами а/б 3. Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция 4. Инкубация 5. Учет результатов 6. Интерпретация

Расчет навески АБП для приготовления базового раствора С (мкг/мл) x Vтеор. (мл) m АБтеор. (мг) = , А (содержание АБП в мкг/мг) где: m АБтеор. - расчетная (теоретическая) навеска АБП; С - необходимая концентрация АБП; Vтеор. - объем растворителя для растворения теоретической навески; А - активность АБП (количество активного вещества, содержащегося в субстанции).

Расчет необходимого количества растворителя m АБпракт. (мг) x Vпракт. (мл) Vпракт. (мл) = , m АБтеор. (мг) где: Vпракт. - объем растворителя для растворения практической навески; m АБпракт. - полученная навеска АБП; m АБтеор. - расчетная (теоретическая) навеска АБП; Vтеор. - объем растворителя для растворения теоретической навески.

Растворители и разбавители, используемые для приготовления основных растворов АБП Для приготовления основных растворов АБП необходимо использовать субстанции АБП с известной активностью. Для взвешивания субстанций необходимо использовать электронные лабораторные весы с точностью до 4 знака. для измерения объемов - калиброванные дозаторы и пипетки. Основные растворы АБП готовят в концентрации 1000,0 мкг/мл и выше.

Определение антибиотикорезистентности. Метод серийных разведений. Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция: Используется суточная культура исследуемых м/о. Концентрация 1,5*10 8 КОЕ/мл, что соответствует степени мутности 0,5 стандарта Мак-Фарланда.

Определение антибиотикорезистентности. Метод серийных разведений.

Определение антибиотикорезистентности. Метод серийных разведений Учет результатов Визуально Спектрофотометрически

Контроль качества Контроль роста культуры в среде без АБП. Контроль чистоты суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды. Каждая партия тестируемых штаммов сопровождается внутренним контролем качества исследования с использованием соответствующих контрольных (референтных) штаммов.

Замечания по методу серийных разведений Необходимо использовать субстанции антибиотиков с известным уровнем активности, Строго соблюдать режимы хранения, Тщательно выполнять контроль качества питательных сред, Трудоемкость приготовления рабочих растворов антибиотиков.

Вывод Использование тест-систем на основе метода микро разведений позволяет избегать трудоемких процедур по стандартизации подготовительных этапов, но при этом обеспечивает получение достоверных количественных результатов по уровню антибиотикорезистентности. Весьма экономичным и простым в исполнении является также вариант метода серийных микро разведений, основанный на использовании двух пороговых концентраций, позволяющий получить качественные результаты

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Основан на диффузии антибиотика с бумажного носителя в агар с исследуемым микроорганизмом и формировании зоны ингибиции роста чувствительных микроорганизмов.

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Этапы: 1. Приготовление ПС 2. Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма 3. Нанесение инокулюма на поверхность ПС 4. Наложение дисков с антибиотиками 5. Инкубация 6. Учет результатов 7. Интерпретация

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Приготовление ПС. Используются: Агар Мюллер-Хинтона АГВ Толщина слоя агара 4 мм(на чашку диам. 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диам. 90 мм – 20). Чашки подсушенные Чашки предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 C* в течение 5 сут.

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма: Используется суточная культура исследуемых м/о. Концентрация 1,5*10 8 КОЕ/мл, что соответствует степени мутности 0,5 стандарта Мак-Фарланда.

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Нанесение инокулюма на поверхность ПС: Производится с помощью ватных тампонов- помещение в инокулюм, отжим о стенки пробирки и высев на ПС штриховыми движениями

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Наложение дисков с а/б: В течении 15 минут Срок годности дисков Соблюдение контроля качества дисков

Октодиски

Аппликация дисков Флаконы с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть мм. На одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с АБП. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Диско-диффузионный метод. Диспенсоры

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Инкубация

Определение антибиотикорезистентности. Диско-диффузионный метод. Учет результатов По измерению зоны ингибиции роста м/о помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45 град. Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм

Измерение зоны ингибиции Линейка лекало

Контроль качества определения чувствительности Внутренний контроль качества исследования. Достоверность результатов исследования чувствительности микроорганизмов к АБП зависит от следующих основных параметров: состава питательной среды; соответствия реальной активности используемых антибиотиков (или их содержания в дисках) паспортным характеристикам соблюдения стандартности выполнения всех лабораторных процедур.

Определение антибиотикорезистентности. Е-тест модификация диско-диффузионного метода. используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной 15 разведений антибиотика размещены с помощью инновационной технологии сухой химии на пластмассовой полоске. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Определение антибиотикорезистентности. Е-тест

Е-тест

Автоматизированные системы

БЛРС БЛРС- термин объединяет большое число бактериальных ферментов, отличающихся способностью расщеплять оксиимино-в-лактамы наряду с пенициллинами и ранними цефалоспоринами и проявляют чувствительность к ингибиторам (клавулановой кислоте, сульбактаму и тазобактаму).

Выявление БЛРС у штаммов Enterobacteriaceae только на штаммы Klebsiella spp. и E. coli. Стандартные диски цефотаксима и цефтазидима (30 мкг) или диска с цефподоксимом (10 мкг), а также диски, содержащие комбинации: цефотаксим + клавуланат или цефтазидим + клавуланат (30/10 мкг) или цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В исследование целесообразно включать одновременно и диски с цефотаксимом и диски с цефтазидимом и их комбинациями с клавуланатом.

Выявление БЛРС у штаммов Enterobacteriaceae Методика приготовления микробной взвеси и инокуляции чашек с агаром стандартные. На поверхность агара накладывают диски с цефалоспоринами и их комбинациями с клавулановой кислотой. Чашки инкубируют в термостате при 35 град. C в течение ч.

Интерпретация результатов Различие в диаметрах зон подавления роста для дисков с цефподоксимом/клавулановой кислотой и цефподоксимом на 6 мм и более, для дисков с цефотаксимом/клавулановой кислотой и цефотаксимом, цефтазидимом/клавулановой кислотой и цефтазидимом - на 5 мм и более свидетельствует о продукции штаммом БЛРС. Необходимо подчеркнуть, что результат считается положительным, если указанные различия получены хотя бы для одной пары дисков.

Метод двойных дисков Метод предполагает использование доступных коммерческих дисков с цефалоспоринами III поколения и с амоксициллином/клавуланатом. Метод "двойных дисков" представляет собой вариант классического ДДМ определения чувствительности, который позволяет выявить продукцию БЛРС по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с каким-либо цефалоспорином III поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту (синергизм отмечается в участке пересечения зон диффузии двух дисков, расположенных на небольшом расстоянии друг от друга).

Метод двойных дисков Методика приготовления микробной взвеси, инокуляции и инкубации чашек не имеет отличий от стандартного ДДМ. Особенностью метода является то, что через мин. после инокуляции на поверхность агара накладывают диски с АБП: в центр - диск, содержащий клавулановую кислоту, обычно в виде комбинации амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг), по бокам от него на расстоянии 20 и 30 мм между центрами дисков - диски с цефтазидимом (30 мкг) и цефотаксимом (30 мкг). Использование двух дисков каждого АБП, расположенных на разном расстоянии от диска с клавулановой кислотой, позволяет повысить эффективность обнаружения БЛРС.

Интерпретация результатов Если тестируемый микроорганизм вырабатывает БЛРС (действие которых в большинстве случаев обратимо клавуланатом), зона подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III поколения окажется "вытянутой" в сторону диска с амоксициллином/клавуланатом. Причиной данного эффекта является дополнительное подавление роста микроорганизма в той зоне, куда диффундируют и клавуланат и цефалоспорин III поколения. Тест сугубо качественный и требует определенных навыков при интерпретации.

КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ S. PNEUMONIAE: Антибактери- альные препараты Содержание в диске (мкг) Диаметр зон подавления роста (мм) РПЧ Эритромицин 15<= >= 21 Кларитромицин 15<= >= 21 Азитромицин 15<= >= 18 Линкомицин 15< >= 21 Клиндамицин 2<= >= 19

Антимикробные препараты Группы микроорганизмов по видовым отличиям по отношению к антимикробным препаратам: Энтеробактерии Неферментирующие бактерии Стафилококки Энтерококки Стрептококки Гемофильная палочка Гонококки М/о со сложными пит. потребностями

Enterobacteriaceae Самостоятельные наборы необходимы для: м/о, выделенных при гнойно-воспалительных заболеваниях различной локализации Возбудителей кишечных инфекций м/о, выделенных при инфекциях МПС

М/о, выделенные при гнойно- воспалительных заболеваниях различной локализации Аминопенициллины Защищенные аминопенициллины Цефалоспорины III поколения Цефтазидим Аминогликозид Фторхинолон Дополнительно Имипенем или меропенем Цефепим, амикацин Цефоперазон/сульбактам Цефуроксим

Возбудители кишечных инфекций Ампициллин Ко-тримоксазол Норфлоксацин или Ципрофлоксацин или Офлоксацин Цефотаксим Дополнительно Цефотаксим или цефтриаксон Тетрациклин или доксициклин хлорамфеникол

Неферментеры Цефтазидим Цефепим Имепенем или меропенем Аминогликозиды Амикацин Ципрофлоксацин Дополнительно Цефоперазон Азтреонам Цефалоспорины IУ поколения Тобрамицин Тикарциллин/клавуланат

Стафилококки Оксациллин Защищенные пенициллины Макролиды Линкозамиды Тетрациклины Аминогликозиды Хлорамфеникол Ванкомицин Фузидин нитрофураны

Энтерококки Ампициллин Стрептомицин Гентамицин Ванкомицин линезолид Ципрофлоксацин Норфлоксацин фосфомицин нитрофурантоин

Пневмококки В-лактамы Макролиды Линкозамиды Ко-тримоксазол Хлорамфеникол Тетрациклины ванкомицин

Контрольные штаммы Для энтеробактерий: E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC Для НФБ - P. aeruginosa ATCC Для стафилококков S. aureus ATCC cер. развед., ATCC для ДДМ Для энтерококков E. faecalis ATCC для сер.разв., S. aureus ATCC для ДДМ Для пневмококков S. pneumoniae ATCC 46619

Спасибо за в нимание !