Современные методы исследования БАС Методы выделения и анализа. Лекция 3

Михаил Семенович Цвет ( ) дата открытия хроматографии (от греч. chroma, родительный падеж chromatos цвет, краска и grapho пишу, черчу, рисую ) доклад «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу» на заседании биологического отделения Варшавского общества естествоиспытателей июня умер от голода, похоронен в Воронеже.

Хроматография физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами: неподвижной - сорбентом и подвижной - элюентом

Сверхкритический флюид (СКФ) Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. CO 2

Фронтальный анализ A + B + Е Исторический интерес Твердо-фазная экстракция A + B + Е A + Е Е ABрастворитель Е

Прявительная хроматогрфия Основной современный метод

Вытеснительная хроматография Высокая нагрузочная способность при невозможности полного разделения Препаративная хроматография

Процесс разделения Элюент Элюат СорбентСорбат

Хроматограмма Время Отклик детектора

Мертвое время (t 0 ) Время выхода неудерживаемого компонента Время нахождения компонентов в подвижной фазе Обычно стараются минимизировать На хр-ме определяется мертвое время ВСЕЙ системы, а не колонки Время Отклик детектора t0t0

Время удерживания (t i ) Легко определяется из хроматограммы Интуитивно понятно Зависит от конструкции системы и скорости потока элюента Не может быть адекватной характеристикой при сравнении хроматограмм Время Отклик детектора t0t0 t1t1 t2t2 t3t3

Исправленное время удерживания (t i ) t i = t i – t 0 Определяет время нахождения компонента в НЕПОДВИЖНОЙ фазе (t s ) Не зависит от конструкции системы Время Отклик детектора t0t0 t1t1 t2t2 t3t3

Удерживаемый объем (V x ) V x = t x * F V x = V x – V 0 Не зависит от скорости потока подвижной фазы 1 хроматограмма: F = 1 мл/мин t 0 = 2 мин t 1 = 5 мин 2 хроматограмма: F = 0.5 мл/мин t 0 = 4 мин t 1 = 10 мин

Свободный объем Свободный объем системы V oc это объем, занимаемый подвижной фазой от устройства для ввода пробы до детектора Свободный объем колонки V m - часть свободного объема системы, находящаяся в пределах колонки В современных хроматографах V ос -> V m Удерживаемый объем является константой данного вещества на данной колонке в подвижной фазе данного состава, но на колонке других размеров он изменяется, несмотря на то, что используются те же сорбент и подвижная фаза.

Фазовое отношение (фи) Фазовое отношение колонки = V s / V m - отношение объемов неподвижной и подвижной фаз в колонке V s = (V s ) V m = (V m )

Коэффициент емкости К (фактор удерживания) Коэффициент емкости К i = (t i -t 0 ) / t 0 - отношение исправленного времени удерживания к мертвому времени Этот параметр не зависит от размеров колонки, непосредственно связан с коэффициентом распределения в данной системе и широко используется в хроматографической литературе и расчетах. Инвариант!

Относительное удерживание (селективность) (альфа) Cелективность это способность хроматографической системы разделять данную пару веществ А и B. BA = t B / t A 1 tBtB t tAtA t0t0 B A

Эффективность

Размывание зоны компонента Теоретическая форма пикаРеальная форма пика

Теория теоретических тарелок Высота эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ) Соответствует высоте слоя сорбента, при прохождении которой акт сорбциидесорбции успевает совершиться в среднем один раз. N = L / H ВЭТТ Отражает качество использованного сорбента и заполнения колонки. H

Эффективность колонки и ширина пика W W 2 W 0.5 h h 0.5 h tRtR

Кинетическая теория размывания Скорость перемещения по колонке отдельных молекул отличается от средней скорости, характерной для данного соединения Неоднородность потока подвижной фазы. Продольная диффузия в неподвижной и подвижной фазах Кинетика массопередачи в неподвижной и подвижной фазах Неравновесность процесса внутри застойных зон

Кинетическая теория размывания Эффективность зависит от: Диаметра зерен сорбента, их геометрии и монодисперсности Качества набивки колонки Мертвого объема системы Скорости потока элюента

Уравнение Ван-Деемтера HВЭТТ = A + B/u + Cu u – скорость потока ПФ h A C B u опт А – Вихревая диффузия B – Молекулярная диффузия C – Сопротивление массопереносу

Влияние удерживания (К), селективности ( ) и эффективности (N) на разделение K = 5 = 1.2 N = K = 5 = 1.7 N = 400 K = 0.5 = 1.4 N =

Критерий разделения Rs W1W1 W2W2 Rs 0.7 Продолжает увеличиваться при увеличении времени второго пика и уже полном разрешении

Коэффициент асимметрии, А s As = W t /W f Взаимодействие образца с силанольными группами сорбента Неоднородность сорбента (мелкая фракция, несферичность) Отравление колонки тяжелыми металлами (в ионной хр-фии) Образование полости в слое сорбента (или его проседание) WfWf WtWt

Разрешение пары соседних пиков

Критерий Кайзера V Изменяется от 0 до 1 Может применяться для несимметричных пиков

Факторы, улучшающие разрешение пиков Увеличение длины колонки Уменьшение внутреннего диаметра колонки Оптимальная скорость потока элюента Однородность сорбента, его сферичность Однородность набивки колонки Уменьшение обьема вводимой пробы Правильный выбор подвижной фазы Использование градиентного элюирования Правильный выбор неподвижной фазы

Флуктуации базовой линии в хроматографии (1) (2) (3) (4) «Белый» шум «Белый» шум со всплесками Периодичный шум Дрейф нулевой линии

Чувствительность и предел обнаружения H пика С, мг/л ) S = dH/dC Чувствительность – наклон градуировочного графика Предел обнаружения – наименьшее содержание, при котором компонент можно обнаружить с заданной вероятностью по данной методике H шума H пика H пика = 3 * H шума

Планарная - бумажная A.Восходящая B.Нисходящая C.Радиальная Механизм разделения – распределительный, нормально-фазовый. Бумага полярна. Применяется редко, замена – ТСХ Применяется для комбинации с электрофорезом – 2D метод

Планарная - ТСХ Подложка – фольга, стекло, полимерные пленки Толщина сорбента – мкм (аналитика), 1-3 мм (препаратив) Сорбенты – силикагель, окись алюминия, C18 etc. 1.Отрезать или взять пластину 2.[ Кондиционировать сорбент] 3.Нанести образец 4.Провести разделение – «ПРОЯВЛЕНИЕ» 5.Визуализировать, Rf 6.Перевести в компьютер ( картинка или хроматограмма )

Планарная - ТСХ 1.Отрезать или взять пластину 2.[ Кондиционировать сорбент] 3.Нанести образец Нанесение образца проводится в случае качественного анализа капилляром, в случае колличественного анализа – микрошприцем или специальным прибором - аппликатором

Планарная - ТСХ Разделение начинают только после уравновешивания! N-камера – нормальная, пластина приводится в равновесие с парами элюента

Планарная - ТСХ

S-камера – сэндвич, неравновесные условия, обратный градиент. Часто используется в варианте « Continuous »

Визуализация Универсальная Специфическая Физическая –UV облучение –Прожигание Химическая –H 2 SO 4 –Перманганат калия –etc. Смешанная – J 2

УФ - лампы UV 254 nm UV 360 nm

УФ + компьютер

Интегрирование

HPTLC Сорбент

HPTLC Преконцентрирование

2D

полный анализ неизвестной смеси (старт?) производительность, параллельность более простое и дешевое оборудование; высокая селективность, в отличие от ВЭЖХ нет ограничений в выборе растворителей; оптимизация только для интересующих компонентов игры с детектированием – проявляющие реагенты Достоинства ТСХ

Недостатки ТСХ ограниченная разделяющая способность из-за сравнительно небольшой длины разделяющей зоны (3-10 см); чувствительность ниже, чем в случае ВЭЖХ; зависимость результатов анализа от окружающей среды: относительной влажности, температуры, а также наличия загрязняющих веществ в воздухе; трудности в работе с образцами, имеющими высокую летучесть, а также с веществами, чувствительными к действию кислорода воздуха или света.