СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Серологические реакции – это реакции между антигенами и антителами in vitro. Цели применения: серодиагностика бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний; сероидентификация выделенных культур различных микроорганизмов (определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов с известными иммунными сыворотками); идентификация видовой принадлежности белков (выявление фальсификации мясных и рыбных изделий).

Классификация серологических реакций в зависимости от характера и физического состояния антигена -Прямые серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация). -Опосредованные реакции – реакции со свидетелями (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента). -Реакции с использованием меток (ферментных, флюоресцирующих и т.д.) для антигена или антитела (иммуноферментный анализ, реакция иммунофлуоресценции, радиоиммунный анализ).

Титр сыворотки – это наиболее высокое разведение сыворотки (наименьшее количество антител), при котором данная серологическая реакция будет положительной. Специфичность серологической реакции – способность антигена реагировать только с гомологичным антителом. Чувствительность серологической реакции - минимальное количество антигенов или антител, которое можно выявить с помощью данной реакции.

Серологические реакции 1. Реакция агглютинации 2. Реакция преципитации 3. Реакции нейтрализации 4. Реакция связывания комплемента 5. Реакция иммунофлуоресценции 6. Радиоиммунологический анализ 7. Иммуноферментный метод (ИФА)

Реакция агглютинации Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) - склеивание и выпадение в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также латексных частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом.

Реакция непрямой гемагглютинации РНГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Для постановки РНГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител в зависимости от цели исследования.

В положительных случаях в лунке осадок имеет вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик).

Реакция преципитации Принцип : При взаимодействии растворимого антигена с антителом в присутствии электролитов (NaCl) образуется комплекс Аг-Ат в виде нерастворимого преципитата. РП применяют в двух целях: выявление антигенов с помощью известной иммунной преципитирующей сыворотки или антител с использованием известных антигенов. Используется как качественный, так и количественный анализ (реакция Манчини). Очень чувствительная реакция для определения антигенов. С помощью РП определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий.

Варианты реакции преципитации в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации. в плотной среде (в агаре, полиакриламидном геле) - реакция преципитации по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза.

Реакция кольцепреципитации Образование комплекса АГ-АТ - + Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку антигена

Реакция проводится в агаре на стеклах или в чашках Петри. В разные лунки в агаре вносится взвесь, содержащая антиген и иммунная сыворотка. Из лунок антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Реакция преципитации в геле по Оухтерлони

Полосы преципитации между антигенами в лунках G, E и иммунной сывороткой (антителами) в лунке A.

Иммуноэлектрофорез ИЭФ чаще всего используется для исследования антигенной структуры микроорганизмов. Принцип и последовательность проведения реакции 1. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. 2. Через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. 3. В канавку вносят специфическую иммунную сыворотку. 4. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются линии преципитации.

Иммуноэлектрофорез Лунки, содержащие смесь антигенов Перемещение антигенов Диффузия антител из канавки и образование полос преципитации

IgG IgM Серологические реакции, основанные на использовании меток МЕТКИ Ферментные Флюоресцирующие радиоизотопные

Иммуноферментный анализ (ИФА или ΕLISA) Метод ИФА или ELISA – это серологическая реакция, в которой для визуализации образовавшегося комплекса антиген-антитело используются ферменты-метки (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза). Эти маркерные (индикаторные) ферменты способны расщеплять субстрат и вызывать изменение цвета среды.

ИФА сэндвич-метод ИФА Обнаружение антител Обнаружение антигена

ИФА Пример: обнаружение антител к ВИЧ

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) РИФ основана на соединении антигенов бактерий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями. Образовавшиеся комплексы АГ- АТ становятся хорошо видимыми под люминесцентным микроскопом. Преимущества РИФ: простота, высокая чувствительность, скорость получения результата.

Прямой метод РИФ - непосредственное соединение антигена с меченым флуоресцентным красителем антителом. Непрямой метод (РНИФ) – 1) образование комплекса антиген- антитело, 2) выявлении этого комплекса путем обработки его меченым флуоресцентным красителем антигаммаглобулиновом (АТ к АТ). Непрямой метод Прямой метод

Люминесцентный микроскоп

Реакция связывания комплемента РСК основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ + АТ. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза ­- взаимодействие антигена и антитела. К исследуемой сыворотке, содержащей антитела, добавляют известный антиген и стандартный комплемент, инкубируют при 37 ° С в течение одного часа. Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка кролика, содержащая гемолитические антитела к эритроцитам барана). К смеси антиген + антитело + комплемент добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37° С в течение мин. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ + АТ (в исследуемой сыворотке специфические антитела присутствовали), то гемолиза эритроцитов не происходит. При отсутствии же в исследуемой сыворотке специфических антител, комплекс АГ + АТ не образуется и комплемент остается несвязанным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов.

Свойства комплемента Эритроциты + гемолитические антитела Комплемент Лизис эритроцитов Реакция гемолиза. В присутствии комплемента под действием гемолитических антител взвесь эритроцитов превращается в «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется в РСК как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия свободного комплемента.

РСК