БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Биологический факультет Кафедра молекулярной биологии Характеристика гена целлюлазы Pectobacterium carotovorum Шарай О.А. Научный руководитель: доцент Николайчик Е.А., Ph. D.

Pectobacterium carotovorum Бактерии Pectobacterium carotovorum наносят значительный ущерб растениям картофеля, вызывая заболевание «черная ножка» (заболевание, приводящее к гибели растения вскоре после прорастания клубней), а также мягкую гниль клубней при хранении.

Основными факторами вирулентности для Pectobacterium считаются: внеклеточные пектатлиазы внеклеточные пектатлиазы внеклеточные целлюлазы внеклеточные целлюлазы внеклеточные протеазы внеклеточные протеазы

Предполагается, что целлюлаза является одним из основных факторов вирулентности Pectobacterium carotovorum. Молекулы целлюлазы состоят из субстратсвязывающего домена на С-конце, соединенного с помощью короткого полилинкерного участка с каталитическим доменом на N-конце. Ген целлюлазы celV кодирует эндоглюконазу семейства 5 Целлюлаза – фактор вирулентности Pectobacterium carotovorum

Цель работы: создание мутанта Pectobacterium carotovorum 3-2 по гену целлюлазы (celV) и оценка роли этого гена в вирулентности бактерий Pca.

Схема получения мутантного штамма P. carotovorum по гену celV pOA3 (JP5603::celV) celV

Создание мутанта Pectobacterium carotovorum 3-2 по гену целлюлазы (celV) Чашечный тест на продукцию секретируемой целлюлазы клетками штамма Pca JN42 (сектор 1) и его мутантов BA1 (сектор 2), BA2 (сектор 3), ВА3 (сектор 4). Электрофореграмма продуктов амплификации хромосомной ДНК штаммов Pca BA1 (дорожки 1 и 5), BA2 (дорожки 2 и 6), ВА3 (дорожки 3 и 7) с использованием праймеров сel1, cel2 и M13/pUC sequencing primer (дорожки 1-3) или сel1, cel2 и M13/pUC reverse sequencing primer (дорожки 5-7) при температуре отжига 50°С. Дорожка 4 - ДНК-маркер (Fermentas#SM0311).

Проверка вирулентности штаммов, мутантных по гену целлюлазы, при заражении клубней картофеля Среднее значение веса мацерированной ткани клубней картофеля сортов Скарб и Живица, зараженных бактериями штаммов Pca JN42, BA1, BA2 и BA3.

Проверка вирулентности штаммов, мутантных по гену целлюлазы, при заражении стеблей картофеля Штамм стебля стебля Pca BA1 Pca BA2 Pca BA3 Pca JN42 151, ,52, ,52,522, ,5 631,522,5 72,52,52,52,5 82,5532 Среднее значение 2,93752,252,1252,6875 Оценка симптомов поражения «черной ножкой» стеблей картофеля сорта Дельфин 0 - нет симптомов заболевания 1 - минимальное поражение 2 - выраженное поражение внутренних тканей 3 - поражение внутренних тканей стебля и небольшое поверхностное потемнение 4- сильное поражение тканей стебля, но не по всему диаметру междоузлия 5 - «черная ножка»: поражены все ткани междоузлия, интенсивная черная окраска, стебель высыхает, его верхняя часть выше места инокуляции поникает

Выводы 1.Введение суицидной плазмиды с фрагментом гена целлюлазы celV в клетки Pectobacterium carotovorum 3-2 привело к инактивации хромосомной копии этого гена. 2.У клеток клонов P. carotovorum 3-2 с инактивацией гена celV целлюлазная активность использованными методами не детектируется. 3.Инактивация гена celV не оказывает существенного влияния на способность бактерий P. carotovorum 3-2 инфицировать клубни картофеля. 4.Инактивация гена celV у бактерий P. carotovorum 3-2 не оказывает существенного влияния на развитие симптомов «черной ножки» при заражении стеблей картофеля.

Спасибо за внимание!