Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Система клонирования белков, обладающих антимикробной активностью Магистерская диссертация Совгир Натальи Владимировны Научный руководитель д.б.н., профессор Прокулевич Владимир Антонович Минск 2009

Антимикробные пептиды (antimicrobial peptides) - очень короткие белковые молекулы, состоящие примерно из аминокислот, которые вырабатываются клетками животных и человека для борьбы с микробами Антимикробные пептиды - часть системы врожденного иммунитета животных. В отличие от антител, они не модифицируются в течение жизни организма и не "подстраиваются" под новые виды возбудителей

Актуальность выбранного направления работы В последнее время актуальна проблема устойчивости штаммов бактерий к традиционным методам терапии, связанных с использованием широкого спектра антибиотических веществ. Бактерии приспосабливаются к любым видам антибиотиков, что сводит на нет все усилия по борьбе с инфекцией, и может привести к полному отказу от антибиотического воздействия на возбудителей инфекционных заболеваний Кроме того, участились случаи заболевания сельскохозяйственных животных эндометритами и маститами, имеющими бактериальную этиологию. Лечение животных по указу вет управления с использованием антибиотиков проводить нежелательно, в связи с чем необходимо осуществлять поиск новых препаратов

Согласно литературным данным, к настоящему времени наиболее изучены пять антимикробных пептидов (temporin A, B и G, esculentin 1b и bombinin H2), выделенных из кожи трех различных видов лягушек и жаб (Rana temporaria, Rana esculenta и Bombina variegata). Все пептиды являются эффективными антибактериальными агентами : temporin A, B и G более эффективны против грамположительных бактерий и действуют при С = от 0,5 до 48 µМ esculentin 1b проявляет активность через 2-20 минуты в основном против грамотрицательных микроорганизмов при С = от 0,5 до 32 µМ bombinin H2 аналогично действует на все виды штаммов бактерий при С = от 4 до 16 µМ

Объект изучения В качестве объекта изучения выступает белок эскулентин который, согласно проведенным исследованиям, активно убивает лекарственно-устойчивые штаммы грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium) в средних и низких концентрациях, и в более низких концентрациях,грамотрицательные штаммы (Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa). Активность молекулы эскулетина семейства 1b обусловлена N-концевой областью (1-18) Из 5 вышеупомянутых антибактериальных белков эскулентин характеризуется наибольшей длинной пептидной цепи (138 аминокислот) и наличием небольшого числа триплетов, кодирующих не характерных для бактерии E. coli аминокислоты

Целью работы является разработка системы клонирования белков, обладающих антимикробной активностью, с использованием плазмиды pET-24a на основе штамма E. coli XL-1blue

Задачами работы являются: 1. Клонирование гена антимикробного белка эскулетина 2. Оптимизация условий экспрессии для получения максимального выхода целевого продукта 3. Очистка белкового продукта и оценка возможности его использования в качестве препарата для лечения эндометритов и маститов сельскохозяйственных животных

Этапы проведения работы На первом этапе был синтезирован ген эскулетина с использованием праймеров F1, R1, F2 и R2. Данные праймеры были сконструированы на основе имеющихся в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации последовательностей Праймер Нуклеотидная последовательность 5'-3' F1 5 ccgtccttaaaagaggtttaaccggccctttttcgaaccg 3 R1 5 cgcctacattcttgagtccgcttatgagcaaatttttcgt 3 F2 5 gggcgttccttcaaccgtacctgcaccactcttgaccgtcga 3 R2 5 caccatcacctttaattttacaacctgcaatgtctaggc 3 Характеристика праймеров F1, R1, F2 и R2

На следующем этапе синтезированный ген эскулетина был использован в качестве матрицы для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции. Размер ожидаемого продукта равен 150 н.п. Рис. 1. Результаты амплификации гена эскулетина с использованием праймеров F1, R1, F2 и R2 Дорожка 1 – продукт амплификации при температуре отжига 60°С Дорожка 2 – маркер молекулярного веса Fermentas SM Продукт амплификации затем был подвергнут рестрикции с использованием рестриктаз NdeI (сайт рестрикции CATATG) и XhoI (сайт рестрикции AAGCTT)

Затем ген эскулетина был клонирован в вектор экспрессии pET-24a(+), которым был трансформирован штамм Escherichia coli XL-1Blue Рис. 2. Карта вектора экспрессии pET-24a(+): T7 промотор Полилинкер (BamH1 – Xho1) Последовательность, кодирующая His-Tag T7 терминатор Последовательность, кодирующая lac Последовательность, отвечающая за устойчивость к Kam

После индукции ИПТГ был получен белковый продукт, который по размеру соответствовал белку эскулетину (около 19 к Да) Рис. 3. Электрофорез суммарных клеточных белков штамма Escherichia coli XL-1Blue (pET-24b(+)+Esc) Дорожка 1 – белки-стандарта молекулярных масс (сверху вниз: 116 к Да, 66 к Да, 45 к Да, 35 к Да, 25 к Да, 18,4 к Да, 14,4 к Да) Дорожка 2 – через 4 ч. после индукции ИПТГ в концентрации 0,4 м Моль/л Дорожка 3 – без индукции ИПТГ к Да

С использованием сконструированных праймеров синтезирован и амплифицирован ген антимикробного белка эскулетина Продукт амплификации клонирован в вектор экспрессии Полученный белковый продукт полностью соответствует белку эскулетину Выводы

Спасибо за внимание ! Exit