ПЦР как один из методов генодиагностики Заведующая отделом диагностики СПИД ЖОЦК Иващенко И.Н.

Презентация:



Advertisements
Похожие презентации
Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Изобретение ПЦР Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис.
Advertisements

ДНК диагностика фитопатогенов. Методы диагностики Визуальный Индикаторные растения Электронная микроскопия Серологическая диагностика ДНК диагностика.
Диагностика ВИЧ-инфекции. Значение результатов теста.
ПЦР – метод амплификации, т.е. получения большого числа копий нужного гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения нужной.
Информация о компании ЗАО «НПФ ДНК-Технология» Основана в 1993 году Специализация: производство оборудования и реактивов для ПЦР, лабораторная диагностика.
Некоторые методы молекулярной биологии Денис Ребриков.
Некоторые методы молекулярной биологии Дей Е.В.. Полимеразная цепная реакция Принцип ПЦР сформулировал Гобинд Корана в 1971 В 1983 Кэри Мюллису удалось.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Контроль качества: Молекулярная диагностика. Контроль качества молекулярной диагностики – Тема Общий подход Взятие, транспортировка и обработка.
Иммунохимические методы анализа в клинической лаборатории.
Методы молекулярной диагностики. Использование молекулярных методов привело к увеличению специфичности, чувствительности диагностики инфекционной и неинфекционной.
Полимеразная цепная реакция Генерозова Анна, 9 класс «А»
Гелевые технологии в иммуногематологии. Гелевая технология это современная технология для оп­ределения антигенов эритроцитов, скрининга и идентификации.
Приоритетный национальный проект в сфере здравоохранения «Профилактика ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С, выявление и лечение больных ВИЧ» Обследование на.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЫСТРЫХ ТЕСТОВ И МЕТОДА ИФА РЯБИЧЕНКО ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ СУМСКАЯ ОБЛАСТНАЯ ИНФЕКЦИОННАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ БОЛЬНИЦА им. З.И. КРАСОВИЦКОГО.
Метод ПЦР и ИФА в диагностике инфекционных заболеваний.
Диагностика гепатитов. II этап. Маркеры вирусных гепатитов. специфические для каждого вируса антигены или антитела, определяемые в крови (гепатоцитах)
Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы Виктория Шкарупо Лаборатория Молекулярной генетики.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Принцип работы Построен на обнаружении участка ДНК или РНК каждого отдельно микроорганизма. Для каждого возбудителя создан.
1. Открытие ПЦР. 2. Проведение ПЦР. 3. ПЦР в медицине 4. ПЦР-диагностика туберкулеза 5. Преимущества ПЦР при диагностике инфекций 6. Недостатки ПЦР при.
Транксрипт:

ПЦР как один из методов генодиагностики Заведующая отделом диагностики СПИД ЖОЦК Иващенко И.Н.

ПЦР – многократное увеличение количества копий специфического участка ДНК инфекционного агента путем полимеразной достройки с помощью термофильного фермента Tag – полимеразы двух олигонуклеотидов – праймеров, ориентированных навстречу друг друга.

Области использования молекулярных методов исследования Фармакология Экология Сельское хозяйство Пищевая промышленность Биотехнология Генетика Медицина

Области использования молекулярных методов исследования -Клиническая диагностика вирусных и бактериальных инфекций - эпидемиология - диагностика наследственных и онкологических заболеваний - HLA-типирование (в т.ч. определение неродственных доноров костного мозга) - судебная медицина для определения отцовства и идентификации личности

Преимущества использования метода ПЦР Увеличение исследуемого образца ДНК в десятки и сотни раз. Простота и достоверность диагностической информации Специфичность, высокая чувствительность Небольшие затраты времени

Этапы ПЦР Пробоподготовка Амплификация Детекция и анализ результатов

Проба ( мкл) Смесь ПЦР (20-40 мкл ) Примеси, ингибиторы ДНК и РНК Задача любой пробоподготовки: перенести ДНК и РНК из большого объема пробы в минимальный объем смеси ПЦР, удалив при этом ингибирующие примеси РНКазы внешней среды Неизбежные ограничения

Плазма крови (жидкая биопроба) Лизис Спиртовое высаживание Раствор ДНК+кДНК – в ПЦР Лизирующий раствор Осадок ДНК+РНК Реагенты обратной транскрипции Обработка вируссодержащей жидкой пробы (плазма крови) Ген Тест-РНК/ДНК-экстракция (ТУ ) Amplicor (Roche)

Исходная биопроба Осадок клеток Прогрев, лизис с сорбентом Лизирующий буфер с сорбентом (ЛБС) Жидкая фаза – в ПЦР Простой метод обработки пробы типа клеточной взвеси (соскоб, смыв)

Щелочная денатурация Связывание произвольных праймеров- гексамеров Достройка праймеров полимеразой Phi29 с вытеснением цепи. Повторение процесса на вытесненных цепях. Продукт WGA – высокополимерная ДНК длиной тыс. н.п., точно копирующая геномную ДНК Схема процесса WGA (whole genome amplification – амплификация полного генома)

Методы идентификации продуктов ПЦР Электрофоретическое разделение в агарозном геле с УФ-детекцией при окрашивании бромистым этидием ГИФА (гибридизационно-ферментный анализ) Real-Time (флуоресцентная метка) (в режиме реального времени)

Требования к лабораторным помещениям 1. Зона обработки проб – соблюдение условий работы с инфекционными агентами 2-й группы (вирусы гепатитов В и С, ВИЧ) обеспечивает сохранность вирусных ДНК и РНК в процессе обработки проб. Это обработка плазмы в ламинаре – область работы с материалом изолирована от внешней среды потоком профильтрованного УФ-облученного воздуха 2. Чистая зона для приготовления смесей реагентов ПЦР. 3. Зона для электрофореза продуктов ПЦР – помещение, строго изолированное от зон 1 и 2 для устранения заносов размноженных фрагментов ДНК в исходную смесь. Не требуется при детекции продуктов ПЦР методом флуориметрии в закрытой пробирке.

к- к+ A B C D E F G H 96 к- к+

Сигнал внутреннего контроля Сигнал возбудителя (если он есть) Возбуждающий свет Гибридизационно-флуоресцентная детекция продуктов после ПЦР Пробирка не вскрывается – устранены ложноположительные результаты Это не ПЦР в реальном времени – намного более дешевое оборудование обеспечивает такую же чувствительность качественного анализа при тех же пониженных требованиях к помещениям и персоналу

Детектор полимеразной цепной реакции флуориметический «Джин» ТУ Производится фирмой «ДНК-технология»

Аппарат для NASBA фирмы BioMereux а также Tigris фирмы GenProbe (1997 г.)

Возможные ограничения применения заявляемой технологии и способы их устранения 1. Ложнопололожительные результаты. Устраняются при переходе от обычного электрофореза к детекции в закрытой системе – флуориметрии после ПЦР. 2. Ложноотрицательные результаты из-за ингибирования ПЦР. Выявляются сразу во всех случаях по сигналу внутреннего стандарта – это заложено в технологию. 3. Ложноотрицательные результаты из-за потерь РНК и ДНК. Выявляются только при систематическом характере. Их выявление сразу во всех случаях возможно при расширении технологии – проведении количественной ПЦР в реальном времени на внутренний стандарт.

Прогнозируемая частота выявления HCV NAT J. Coste, H.W. Reesink et al / Vox Sanguinis, 2005, v.88, p Получен. на 1 млн Донации крови N получен. Всего Европа 0, Северная Америка Тихоокеан. регион

Прогнозируемая частота выявления HIV-1 NAT J. Coste, H.W. Reesink et al / Vox Sanguinis, 2005, v.88, p Получен. на 1 млн Донации крови N получен. Всего Европа 0, Северная Америка 0, Тихоокеан. регион 0,

Период серонегативного окна при исследовании методами ИФА-Ат, ИФА-Аг и ПЦР HIVHBVHCV Антитила 2270 Антигены ДНК/РНК

Серонегативное окно: HIV-инфекция = 5-6 дней

Соотношение между количеством копий/мл РНК и концентрацией р 24 в сыворотке ВИЧ – инфицированного – Достоверная чувствительность ПЦР – 1000 копий/мл. – При мини пуле из 100 сывороток чувствительность ПЦР копий/мл. – При копий/мл РНК на стадии сероконверсии в сыворотке приблизительно 20 пг/мл р 24.

Риск передачи HCV, HBV и HIV с кровью в период серонегативного окна среди доноров, кровь которых прошла все скрининговые тесты: HCV – 1 на , HBV – 1 на , HIV – 1 на – 1 на 4,5 млн. (ПЦР) (Schreiber et l., NEJM, 1996,334,1685)

Годы ВИЛСифилис по Украине по области по Украине по области ,723,2529,2992, ,633,4598,9793, ,421,7636,91097, ,677,31272,41798, ,568,91375,62275, ,1103,11237,051913, ,7122,61226,71654, ,7149,01047,91530,2 Распространенность маркеров гема трансмиссивных инфекций среди доноров на 100 тыс. донаций

Годы Гепатит ВГепатит С по Украине по области по Украине по области ,7947,22448,61649, ,5943,52551,41370, ,62700,51582, ,0953,52921,62010, ,8980,12775,42403, ,6845,42337,42120, ,6720,12295,72114, ,31151,92229,62258,0 Распространенность маркеров гема трансмиссивных инфекций среди доноров на 100 тыс. донаций