ПЦР как один из методов генодиагностики Заведующая отделом диагностики СПИД ЖОЦК Иващенко И.Н.

ПЦР – многократное увеличение количества копий специфического участка ДНК инфекционного агента путем полимеразной достройки с помощью термофильного фермента Tag – полимеразы двух олигонуклеотидов – праймеров, ориентированных навстречу друг друга.

Области использования молекулярных методов исследования Фармакология Экология Сельское хозяйство Пищевая промышленность Биотехнология Генетика Медицина

Области использования молекулярных методов исследования -Клиническая диагностика вирусных и бактериальных инфекций - эпидемиология - диагностика наследственных и онкологических заболеваний - HLA-типирование (в т.ч. определение неродственных доноров костного мозга) - судебная медицина для определения отцовства и идентификации личности

Преимущества использования метода ПЦР Увеличение исследуемого образца ДНК в десятки и сотни раз. Простота и достоверность диагностической информации Специфичность, высокая чувствительность Небольшие затраты времени

Этапы ПЦР Пробоподготовка Амплификация Детекция и анализ результатов

Проба ( мкл) Смесь ПЦР (20-40 мкл ) Примеси, ингибиторы ДНК и РНК Задача любой пробоподготовки: перенести ДНК и РНК из большого объема пробы в минимальный объем смеси ПЦР, удалив при этом ингибирующие примеси РНКазы внешней среды Неизбежные ограничения

Плазма крови (жидкая биопроба) Лизис Спиртовое высаживание Раствор ДНК+кДНК – в ПЦР Лизирующий раствор Осадок ДНК+РНК Реагенты обратной транскрипции Обработка вируссодержащей жидкой пробы (плазма крови) Ген Тест-РНК/ДНК-экстракция (ТУ ) Amplicor (Roche)

Исходная биопроба Осадок клеток Прогрев, лизис с сорбентом Лизирующий буфер с сорбентом (ЛБС) Жидкая фаза – в ПЦР Простой метод обработки пробы типа клеточной взвеси (соскоб, смыв)

Щелочная денатурация Связывание произвольных праймеров- гексамеров Достройка праймеров полимеразой Phi29 с вытеснением цепи. Повторение процесса на вытесненных цепях. Продукт WGA – высокополимерная ДНК длиной тыс. н.п., точно копирующая геномную ДНК Схема процесса WGA (whole genome amplification – амплификация полного генома)

Методы идентификации продуктов ПЦР Электрофоретическое разделение в агарозном геле с УФ-детекцией при окрашивании бромистым этидием ГИФА (гибридизационно-ферментный анализ) Real-Time (флуоресцентная метка) (в режиме реального времени)

Требования к лабораторным помещениям 1. Зона обработки проб – соблюдение условий работы с инфекционными агентами 2-й группы (вирусы гепатитов В и С, ВИЧ) обеспечивает сохранность вирусных ДНК и РНК в процессе обработки проб. Это обработка плазмы в ламинаре – область работы с материалом изолирована от внешней среды потоком профильтрованного УФ-облученного воздуха 2. Чистая зона для приготовления смесей реагентов ПЦР. 3. Зона для электрофореза продуктов ПЦР – помещение, строго изолированное от зон 1 и 2 для устранения заносов размноженных фрагментов ДНК в исходную смесь. Не требуется при детекции продуктов ПЦР методом флуориметрии в закрытой пробирке.

к- к+ A B C D E F G H 96 к- к+

Сигнал внутреннего контроля Сигнал возбудителя (если он есть) Возбуждающий свет Гибридизационно-флуоресцентная детекция продуктов после ПЦР Пробирка не вскрывается – устранены ложноположительные результаты Это не ПЦР в реальном времени – намного более дешевое оборудование обеспечивает такую же чувствительность качественного анализа при тех же пониженных требованиях к помещениям и персоналу

Детектор полимеразной цепной реакции флуориметический «Джин» ТУ Производится фирмой «ДНК-технология»

Аппарат для NASBA фирмы BioMereux а также Tigris фирмы GenProbe (1997 г.)

Возможные ограничения применения заявляемой технологии и способы их устранения 1. Ложнопололожительные результаты. Устраняются при переходе от обычного электрофореза к детекции в закрытой системе – флуориметрии после ПЦР. 2. Ложноотрицательные результаты из-за ингибирования ПЦР. Выявляются сразу во всех случаях по сигналу внутреннего стандарта – это заложено в технологию. 3. Ложноотрицательные результаты из-за потерь РНК и ДНК. Выявляются только при систематическом характере. Их выявление сразу во всех случаях возможно при расширении технологии – проведении количественной ПЦР в реальном времени на внутренний стандарт.

Прогнозируемая частота выявления HCV NAT J. Coste, H.W. Reesink et al / Vox Sanguinis, 2005, v.88, p Получен. на 1 млн Донации крови N получен. Всего Европа 0, Северная Америка Тихоокеан. регион

Прогнозируемая частота выявления HIV-1 NAT J. Coste, H.W. Reesink et al / Vox Sanguinis, 2005, v.88, p Получен. на 1 млн Донации крови N получен. Всего Европа 0, Северная Америка 0, Тихоокеан. регион 0,

Период серонегативного окна при исследовании методами ИФА-Ат, ИФА-Аг и ПЦР HIVHBVHCV Антитила 2270 Антигены ДНК/РНК

Серонегативное окно: HIV-инфекция = 5-6 дней

Соотношение между количеством копий/мл РНК и концентрацией р 24 в сыворотке ВИЧ – инфицированного – Достоверная чувствительность ПЦР – 1000 копий/мл. – При мини пуле из 100 сывороток чувствительность ПЦР копий/мл. – При копий/мл РНК на стадии сероконверсии в сыворотке приблизительно 20 пг/мл р 24.

Риск передачи HCV, HBV и HIV с кровью в период серонегативного окна среди доноров, кровь которых прошла все скрининговые тесты: HCV – 1 на , HBV – 1 на , HIV – 1 на – 1 на 4,5 млн. (ПЦР) (Schreiber et l., NEJM, 1996,334,1685)

Годы ВИЛСифилис по Украине по области по Украине по области ,723,2529,2992, ,633,4598,9793, ,421,7636,91097, ,677,31272,41798, ,568,91375,62275, ,1103,11237,051913, ,7122,61226,71654, ,7149,01047,91530,2 Распространенность маркеров гема трансмиссивных инфекций среди доноров на 100 тыс. донаций

Годы Гепатит ВГепатит С по Украине по области по Украине по области ,7947,22448,61649, ,5943,52551,41370, ,62700,51582, ,0953,52921,62010, ,8980,12775,42403, ,6845,42337,42120, ,6720,12295,72114, ,31151,92229,62258,0 Распространенность маркеров гема трансмиссивных инфекций среди доноров на 100 тыс. донаций