Характеристика плазмид биодеградации нафталина группы IncP7. Научный Руководитель: докт. биол. наук, профессор Титок М. А. Выполнила: Магистрантка биологического факультета БГУ Чернова А. И. Минск 2009

Актуальность.Актуальность. Загрязнение окружающей среды органическими соединениями природного и антропогенного происхождения – одна из экологических проблем современного общества. Загрязнение окружающей среды органическими соединениями природного и антропогенного происхождения – одна из экологических проблем современного общества. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют серьезную опасность для здоровья человека (Токсичность, канцерогенность). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют серьезную опасность для здоровья человека (Токсичность, канцерогенность). Некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве может происходить за счет: Некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве может происходить за счет: a) абиотических процессов; a) абиотических процессов; b) деятельности микроорганизмов b) деятельности микроорганизмов Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas Способность деградировать нафталин детерминируется плазмидами P-9, P-7 и P-2 групп несовместимости. Наиболее изученными является IncP-9 группа, IncP-2 и IncP-7 изучены достаточно слабо. Способность деградировать нафталин детерминируется плазмидами P-9, P-7 и P-2 групп несовместимости. Наиболее изученными является IncP-9 группа, IncP-2 и IncP-7 изучены достаточно слабо. Загрязнение окружающей среды органическими соединениями природного и антропогенного происхождения – одна из экологических проблем современного общества. Загрязнение окружающей среды органическими соединениями природного и антропогенного происхождения – одна из экологических проблем современного общества. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют серьезную опасность для здоровья человека (Токсичность, канцерогенность). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) представляют серьезную опасность для здоровья человека (Токсичность, канцерогенность). Некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве может происходить за счет: Некоторое уменьшение концентрации ПАУ в почве может происходить за счет: a) абиотических процессов; a) абиотических процессов; b) деятельности микроорганизмов b) деятельности микроорганизмов Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas Способность деградировать нафталин детерминируется плазмидами P-9, P-7 и P-2 групп несовместимости. Наиболее изученными является IncP-9 группа, IncP-2 и IncP-7 изучены достаточно слабо. Способность деградировать нафталин детерминируется плазмидами P-9, P-7 и P-2 групп несовместимости. Наиболее изученными является IncP-9 группа, IncP-2 и IncP-7 изучены достаточно слабо.

Цель работы: характеристика Nah-плазмид IncP-7, выделенных из клеток природных хозяев. В связи с поставленной целью в работе последовательно решались следующие задачи: 1. Выделить плазмиды биодеградации нафталина Р-7 группы из природных штаммов и охарактеризовать области их репликации. 2. Установить видовую принадлежность природных штаммов-хозяев плазмид группы IncP-7; 3. Изучить круг бактериальных хозяев плазмид Р-7 группы и определить характер их наследования в чужеродном генетическом окружении; 4. Исследовать динамику роста и утилизации нафталина штаммами, содержащими плазмиды группы IncP-7 в модельных системах.

Объект и предмет исследования: ОБЪЕКТ: Плазмиды биодеградации нафталина группы IncP-7ПРЕДМЕТ: Принадлежность к Р-7 группе несовместимости; Генетическая организация; Видовая принадлежность природных штаммов- хозяев; Зависимость от генетического окружения; Динамика роста и утилизации нафталина в модельных системах

Характеристика природных нафталин утилизирующих бактерий

Идентификация плазмид Р-7 групп несовместимости. Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации rep-областей плазмид группы IncP-7. Продукты амплификации получены с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК штаммов: 1 – AL1, 2 – AL2, 3 – AL3, 4 – AL9, 5 – AL38, 6 – AL43, 7 – P.putida/pOS19, 8 – P.putida/Rms148, 9 – в реакционную смесь не добавлялась тотальная ДНК. Дорожка 10 соответствует реперу DNA Ladder Mix. Рисунок 2. Электрофореграмма продуктов амплификации rep-областей плазмид группы IncP-9. Продукты амплификации получены с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК штаммов: 1 – AL1, 2 – AL2, 3 – AL9, 4 – AL38, 5 – AL3, 6 – AL43, 7 – P.putida/рМ3. Дорожка 8 соответствует реперу DNA Ladder Mix. Идентификация плазмид Р-7 групп несовместимости

Несовместимость плазмид природных штаммов AL1, AL2 и АL3 с типовыми плазмидами группы IncP-7 и IncP-9

Рестрикционный анализ продуктов амплификации. Рисунок 3. Результаты рестрикционного анализа продуктов амплификации rep- генов плазмид группы IncP-9. Продукты амплификации, обработанные рестриктазой HaeIII, получены с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК штаммов: 1 – AL3, 2 –AL43, 3 – P.putida/pNL10 ( -подгруппа). Дорожка 4 соответствует реперу DNA Ladder Mix.

Рестрикционный анализ продуктов амплификации. Рисунок 4. Результаты рестрикционного анализа продуктов амплификации rep- областей плазмид группы IncP-7. Продукты амплификации, обработанные рестриктазами StyI (A), XhoI (B), AvaI (C), BglI (D) и Sau3A (E) получены с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК штаммов: 1 – AL1, 2 –AL2, 3 – AL3, 4 – AL9, 5 – AL38, 6 – AL43, 7 – P.putida/pOS19 (IncP-7), 8 – P.putida/Rms148 (IncP-7). Дорожка 9 соответствует реперу DNA Ladder Mix. A. B. C. D. E.

Идентификация видовой принадлежности природных штаммов-хозяев плазмид Р-7 группы несовместимости. 1.Физиолого-биохимические тесты.

2.1 ПЦР с праймерами к 16S-РНK Рисунок 5. Электрофореграмма продуктов амплификации генов 16S рРНК. Продукты амплификации получены с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК штаммов: 1 – AL1, 2 – AL2, 3 – AL3, 4 – AL38, 5 – AL9, 6 – AL43, 7 – P.putida КТ2442, 8 – P. fluorescens B894, 9 – в реакционную смесь не добавлялась тотальная ДНК. Дорожка 10 соответствует реперу DNA Ladder Mix.

2.2 Рестрикция продуктов амплификации с праймерами к 16S-РНK. Рисунок 6. Результаты рестрикционного анализа продуктов амплификации генов 16S рРНК.Продукты амплификации, обработанные рестриктазами HaeIII (А), MspI (B) и RsaI (C) получены с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК штаммов: 1 – AL1, 2 –AL2, 3 – AL3, 4 – AL38, 5 – AL9, 6 – AL43, 7 – P.putida КТ2442, 8 – P. fluorescens B894. Дорожка 9 соответствует реперу DNA Ladder Mix.

Частота переноса и стабильность наследования плазмиды pAL1 в различных штаммах.

Динамика скорости роста плазмид содержащихштаммов в жидкой среде с нафталином. a. P.putida KT2442/pAL1 d. P.stutzeri B975/pAL1 b. P.aureofaciens B1249/pAL1 e. P.putida M F19/pAL1 c. P.lachrimans B146/pAL1 f. P.mendocina РМ2/pAL1

Исследование динамики роста в модельной почвенной системе. Примечание: определение концентрации жизнеспособных клеток проводили через сутки

Эффективность деградации нафталина в модельной почвенной системе. Примечание: определение концентрации жизнеспособных клеток проводили через сутки

1. С использованием метода амплификации и классического теста на несовместимость выявлено 6 плазмид, принадлежащих к Р-7 группе несовместимости (обозначены pAL1, pAL2, pAL3, pAL9, pAL38, pAL43). Рестрикционный профиль данных плазмид отличается от такового типовой плазмиды Rms148, но сходен между собой.метода амплификации классического теста на несовместимость Рестрикционный профиль 2. С использованием ряда физиолого-биохимических тестов и метода ARDRA определена видовая принадлежность штаммов-природных хозяев плазмид Р-7 группы несовместимости. Штаммы AL1, AL2, AL3, AL9, AL43 отнесены к P. putida, а AL38 - к P. fluorescens.физиолого-биохимических тестов метода ARDRAвидовая принадлежность 3. Осуществлено встраивание транспозонов miniTn5, детерминирующих устойчивость к канамицину и стрептомицину в состав плазмид pAL1 и pAL2 группы IncP Осуществлен перенос плазмиды pAL1 в 21 бактериальный штамм рода Pseudomonas. Установлены частоты переноса плазмиды pAL1 в ряд бактериальных штаммов, составившие от 2, (для бактерий P.putida M F19) до 2, (для бактерий P.aeruginosa ML4600).частоты переноса

5. Для большинства плазмид содержащих штаммов показано, что плазмида pAL1 наследуется стабильно или утрачивается с невысокой частотой. Наибольшая степень утраты плазмиды наблюдалась для бактерий P.palleronii и P.artrofaciens (53% и 73%, соответственно).стабильно 6. Для исследуемых штаммов была определена скорость роста на твердой и в жидкой среде с нафталином (для 22 и 6 штаммов, соответственно). Было предложено разбить плазмид содержащие штаммы на группы в соответствии со скоростями их роста( быстро-, средне-, медленнорастущие).скорость роста 7. Была изучена динамика роста и эффективность деградации нафталина плазмид содержащими штаммами в модельной почвенной системе. Штаммы, несущие в своем составе NAH-плазмиду способны стабильно существовать и поддерживаться в почвенной среде с нафталином. Стационарной фазы роста быстрее остальных достигал штамм P.putida KT2442/pAL1. Для данного штамма была также показана лучшая эффективность утилизации нафталина.динамика роста эффективность деградации нафталина