PROPRIETĂŢILE GENERALE ALE PROTEINELOR

Obiectivele: 1. Proprietăţile fizico-chimice ale proteinelor 2. Masa moleculară, metode de deteminare 3. Solubilitatea proteinelor, factorii ce o influienţează. 4. Proprietăţile soluţiilor proteice (coloizi). Factorii de stabilizare în soluţie a substanţelor coloidale. 5. Starea soluţiilor coloidale sol, gel, xerogel. Exemple. 6. Sarcina electrică a proteinelor. Punctul şi starea izoelectrică. 7. Denaturarea proteinelor, agenţii ce provoacă denaturarea. Ce modificări suferă structura proteinei la denaturare. 8. Coagularea proteinelor. Factorii care previn coagularea. 9. Metodele de studiere a componenţei calitative şi cantitative a proteinelor a) hidroliza b) cromatografie c) electroforeza d) salifiere e) dializa f) gel-filtrare

Proprietăţi fizico-chimice Masă moleculară Solubilitatea proteinelor Proprietăţile amfotere Sarcina electrică a proteinei Denaturarea

Masă moleculară a proteinelor este mare: intre şi Daltoni. se determină prin următoarele metode: 1. prin calcul cu ajutorul compoziţiei chimice cunoscute: Ex: Masa mol. a Hb (Fe)=56x100 / 0,34=16470Da 2. mărimea presiunii osmotice, constanta ultracentrifugării (pr. sedimentează în raport cu m şi mărimea lor) 3. Metoda difuziunii luminii (intensitatea ei e dependentă de nr. particulelor şi de m ei) 4. Mărimea difracţiei razelor Roentgen 5. Microscopia electronică

Masa moleculară a diferitelor proteine

Solubilitatea proteinelor Proteinele - substanţe cu proprietăţi hidrofile Solubilitatea variază în limite mari: - Proteinele globulare prezintă grade diferite de solubilitate, - cele fibrilare sunt insolubile în apă.

Solubilitatea este deteminată de: – prezenţa pe suprafaţa moleculei proteice a resturilor AA cu sarcini electrice (COO- ; NH3+) şi de grupări polare (OH-, SH) care interacţionează cu dipolul de apă. – de particularităţile de organizare (proteinele globulare se dizolvă mai bine faţă de cele fibrilare)

Solubilitatea este influenţată de: – PH-ul mediului, care modifică sarcina electrică a P – Temperatură – de proprietăţile solventului (ex:apa pură, soluţii saline slabe;). – Prezenţa sărurilor metalelor uşoare – Na Cl, MgCl2, Na2SO4, care: 1. la concentraţii mici măresc solubilitatea proteinelor 2. la concentraţii mari scad solubilitatea proteinelor şi ele precipită. Acest proces se numeşte salifiere.

Stabilitatea soluţiei proteice e determinată de 2 factori: sarcina electrică – determină respingerea moleculelor proteice încărcate pozitiv sau negativ. membrana apoasă care îndepărtează moleculele proteice una faţă de alta impedicând agregarea şi precipitarea lor.

Membrana apoasă (apa fixată) Se formează la interacţiunea grupelor ionogene ce fixează dipolii de apă Grupa COO fixează 4 mol de H2O, NH2- -3; OH şi NH – câte 2. Apa ce intră în componenţa membranei apoase e numită apă legată

Proprietăţile apei fixate 1. moleculele ei au o dispunere mai compactă, ce o apropie de un corp solid 2. proprietăţile ei de solvent sunt reduse 3. îngheaţă la temperaturi joase( -40C) 4. constanta dielectrică (forţa de atracţie dintre ionii încărcaţi opus) este de 2,8, pe cînd la H2O obişnuită este de 8

Proprietăţile electrochimice Pr. prezintă polielectroliţi amfoteri Sarcina electrică este determinată: 1. de componenţa AA: 1. dacă predomină AA acizi (Glu,Asp) sarcina sumară a proteinei va fi negativă 2. dacă predomină AA bazici (Lys,Arg) sarcina sumară a proteinei va fi pozitivă -

Sarcina electrică este influenţată 2. de pH mediului: În apă aminoacizii se comportă ca ţvetiriioni În mediu acid sarcina sumară va fi pozitivă În mediu bazic sarcina sumară va fi negativă Datorită acestui fapt la trecerea unui curent electric în soluţie, AA vor migra în mediu acid spre catod(-), iar în mediu alcalin spre anod(+).

Punct izoelectric - Este o valoare a pH-ului la care suma sarcinilor pozitive este egală cu suma sarcinilor negative (migrarea proteinelor sau a AA într-un cîmp electric este nulă) - se notează pHi şi este diferit pentru fiecare aminoacid sau proteină. În această formă se exercită forţe de atracţie reciproce între grupările – COO- şi - NH3+; are loc o aglomerare a moleculelor din soluţie şi solubilitatea devine minimă.

pHi Pentrui AA neutri se află între pH 5- 6 Pentrui AA bazici se află în mediu bazic Pentrui AA acizi se află în mediu acid

Sarcina proteinei La un pH mai acid ca valoarea pHi proteina capătă o sarcină pozitivă (cation) şi migrează spre catod(-); la PH mai mare ca pHi proteina capătă o sarcină negativă şi migrează spre anod(+)

Proprietăţile coloidale şi osmotice ale proteinelor Proteinele sunt substanţe macromoleculare,solubile, la dizolvarea cărora se formează soluţii coloidale proteice. Spre deosebire de soluţiile coloidale obişnuite, soluţiile proteice nu necesită prezenţa stabilizatorului. Soluţiile proteice sunt stabile şi cu timpul nu se precipită.

Soluţiile proteice posedă proprietăţi caracteristice soluţiilor coloidale: Proprietăţile optice (efectul Tindal) Viteză de difuzie mică. Viscozitate mare Proprietăţi osmotice Proprietatea de a forma geluri

Proprietăţile optice La iluminarea laterală a soluţiei proteice raza de lumină în ea devine vizibilă, formând conul de lumină- efectul Tindal. Acest efect de dispersie a luminii se explică prin difracţia razelor de lumină de către particulele în soluţie. Capacitatea proteinelor de a dispersa lumina este folosită: 1. la determinarea cantitativă a proteinelor prin metoda nefelometrică 2. la studierea microscopică a structurilor celulare. Soluţiile proteice posedă absorbanţă în limitele spectrului ultrafiolet, caracterizată de prezenţa in ele a resturilor aminoacizilor fenilalanina, tirozina şi triptofan. Fenilalanina şi tirozina are absorbanţa maximă la lungimea de undă 280 nm, iar triptofanul nm.

Viteză de difuzie mică. Difuzie – deplasarea spontană a moleculelor substanţei dizolvate datorită gradientului de concentraţie (de la zone cu concentraţii mai mare spre cele cu concentraţie scăzută). Viteza de difuzie a proteinelor depinde mai mult de forma moleculei, decât de masa ei. Repartizarea intracelulară a proteinelor din locul de sinteză (ribosomi) are loc prin difuzie. Deoarece viteza de difuzie e mică are loc limitarea vitezei proceselor dependente de funcţiile proteinelor difuzabile în sectorul respectiv.

Viscozitate mare – e dependentă de masa şi forma moleculelor. Mărirea c% proteinei conduce şi la mărirea viscozităţii soluţiei (se măresc forţele de coeziune între moleculele proteice). Proteinele fibrilare sunt mai vîscoase comparativ cu cele globulare. Viscozitatea e dependentă de: 1. temperatură- t0 - viscozitatea 2. prezenţa electroliţilor (ex. sărurile de Ca2+ măresc viscozitatea prin formarea punţilor de Ca2+)

Proprietăţi osmotice proteine fiind macromolecule – nu difundează prin membrane semipermiabile, pe când micromoleculele trec prin asemenea membrane. Acest proces e numit dializă. Incapacitatea de a difuza prin membranele semipermiabile are ca urmare apariţia fenomenului de osmoză (deplasarea mol. de H2O prin membrană în soluţia proteică). Deplasarea apei este limitată de presiunea hidrostatică (presiunea coloanei de apă) şi se numeşte presiune osmotică Presiunea osmotică depinde de concentraţia molară a proteinei şi de temperatură. Presiunea osmotică determinată de proteine – presiune oncotică.

Proprietatea de a forma geluri Proteinele prezintă coloizi liofili, şi deci pot forma geluri. Moleculele proteinei interacţionează între ele formînd reţele structurale în interiorul cărora se imobilizează apa. Gelatinizarea are loc mai uşor în sol. pr. fibrilare Formarea de gel se observă la coagularea sîngelui (formarea reţelei de fibrină). La învechirea gelurilor are loc sinerezisa – expulzarea apei, datoprită contracţiei mol din reţea şi eliminarea apei.

Formarea gelului depinde de : concentraţia soluţiei (odată cu creşterea concentraţiei); temperatură (la scăderea temperaturii); concentraţia ionilor de hidrogen (în punctul izoelectric se observă o viteză maximă de formare a gelului); prezenţa electroliţilor (Ionul SO4 2- contribuie în mod preferat la transformarea solului în gel).

Xerogel este gelul secat (uscat) - lipsit de apă. se capătă prin secare liofilă a soluţiilor coloidale Secarea liofilă constă în îndepărtarea apei în vid din soluţia coloidală îngheţată. se păstrează un timp mai îndelungat ceea ce prezintă importanţă practică în industria de preparare a medicamentelor de origine proteică. Ex: deferite proteine (albumina, gama-globulinele şi altele).

Denaturarea proteinelor este distrugerea nivelurilor superioare de organizare ale moleculei proteice (secundar, terţiar, cuaternar) în afară de structura primară cu pierderea proprietăţile fizico-chimice şi biologice ale proteinei. Agenţii denaturanţi se împart în fizici şi chimici. 1. factorii fizici: temperatura, presiunea, radiaţiile ultraviolete şi ionizante. 2. factorii chimici : acizi, bazele, solvenţii organici, detergenţii, amidele, sărurile metalelor grele.

Trăsăturile proteinei denaturate: – pierderea activităţii biologice – micşorarea solubilităţii – schimbarea formei şi mărimii moleculelor – creşterea reactibilităţii unor grupe – pierderea capacităţii de a se cristaliza

Substanţele ce pot împedica denaturarea soluţii de glucide glicerina a. graşi Pentru a evita denaturarea proteina se păstrează la rece, în soluţii concentrate de săruri la un PH anumit

Renaturare (renativare). - este restabilirea structurii şi activităţii biologice a proteinei la înlăturarea agentului denaturant.

Metodele de studiere a componenţei calitative şi cantitative a proteinelor a) hidroliza (ruperea unei legăturin ordinare cu adiţia unei molecule de apă) b) cromatografie c) electroforeza d) salifiere e) dializa f) gel-filtrare

Cromatografie - este identificarea şi separarea aminoacizilor. Principiul: Metoda este bazată pe diferenţa coeficientului de repartiţie a aminoacizilor în apă şi solvent organic (butanol), care nu se amestecă cu apa. Apa se absoarbe pe hîrtia cromatografică, constituind faza staţionară, iar solventul organic, migrează pe ea. Concomitent cu ultimul se mişcă şi aminoacizii. Viteza migrării aminoacizilor pe banda cromatografică este direct proporţională cu gradul de solubilitate în butanol.

Electroforeza - este metoda de separare a particulelor ce posedă sarcină (proteine) într-un cîmp electric Direcţia migrării Pr depinde de pH-ul mediului; Pr fiind electroliţi amfoteri în mediul acid ele posedă sarcină + şi se mişcă spre C, în mediul bazic posedâ sarcină -migrează spre A. Separarea Pr din serul sanguin La pH-ul 8,6 -8,9 în câmpul electric continuu Pr serului posedă sarcina negativă şi vor migra spre A cu o viteză care depinde în aceeaşi măsură de mărimea sarcinii electrice şi de masa moleculară a particulelor. În rezultat se separă Albumine(care agung primele),apoi globulinele care se separă în fracţii: 1, 2; şi în final -globulinele.

Salifierea - este metoda de precipitare a P din soluţie la acţiunea c %mari de săruri neutre (sulfatul de amoniu, clorura de sodiu şi al.) este un proces reversibil. Mecanismul salifierii se reduce la dehidratare macromoleculelor proteice şi înlăturarea sarcinii electrice. Asupra vitezei de precipitare a proteinelor prin salifiere acţionează un şir de factori ca: hidrofilitatea proteinei, masa moleculară, sarcina electrică; de aceea salifiere diferitelor proteine are loc în concentraţii diferite de săruri. De exemplu, albuminele se precipită în soluţie saturată de sulfat de amoniu, pe când globulinele - în soluţie semisaturată

Dializa proteinelor Dializa (din greceşte dialisis - separare) – metoda de separare şi purificare a substanţelor macromoleculare şi soluţiilor coloidale de substanţe micromoleculare cu ajutorul membranelor semipermeabile (celofan, pergament etc.). Prin porii acestor membrane pot trece numai substanţele micromoleculare, ce au masă moleculară şi dimensiuni mici. Membrana nu poate fi traversată de proteine şi alte macromolecule.

Gel filtrare Sitele moleculare sunt formate din granule de gel polizaharidic inert hidratat. Granulele posedă pori de diferit diametru. Micromoleculele cu dimensiuni mici pătrund prin aceşti pori,macromoleculele- nu. V migrării micromol. prin coloană este mai mică decît a macromol. - fapt ce permite purificarea proteinelor de subst micromoleculare. Viteza migrării proteinelor prin coloană este în funcţie de masa şi dimensiunile lor – se mişcă mai repede cele ce au m şi d mai mari.