СОЗДАНИЕ ШТАММА PSEUDOMONAS PUTIDA B-37 – ПРОДУЦЕНТА АЦК - ДЕЗАМИНАЗЫ Магистерская диссертация Мельниковой А. А. Научный руководитель : к. б. н., доцент кафедры генетики Храмцова Елена Аркадьевна

Цель работы Объект исследования Определение ризосферной локализации бактерий P. putida с... Скрининг коллекции ризосферных бактерий P. putida на нал... Клонирование acdS- гена бактерий P. putida B-37 в клетках... Лигирование с T- вектором Рестрикция рекомбинантной плазмидной ДНК Проверка наличия плазмиды p РВ 37 в клетках E. coli Xl-1 bl... Изучение экспрессии acdS- гена в гомо - и гетерологичной с... Активность АЦК - дезаминазы у изучаемых бактерий Выводы

Цель работы : создание штамма P.putida B-37- продуцента АЦК - дезаминазы. Задачи : Определить ризосферную локализацию бактерий P. putida с помощью флюоресцентной микроскопии. Провести скрининг коллекции ризосферных бактерий P.putida на наличие гена acdS. Амплифицировать acdS- ген бактерий P. putida B-37 и клонировать данный ген составе Т - вектора в клетках E. coli Xl-1 blue. Клонировать acdS- ген бактерий P. putida B-37 в составе вектора широкого круга хозяев. Определить экспрессию acdS- гена бактерий P. putida B-37 в гомо - и гетерологичной системах.

Объект исследования P.putida B-37 P. putida B-27 P. putida B-28 P. putida М E. coli Xl-1blue P. putida КТ

12 Рисунки 1,2 - Корень растений томатов, предварительно обработанных суспензией бактерий P.putida В-27 (1) и P.putida В-37(2), соответственно, и помещённый на газированную питательную среду в чашку Петри Определение ризосферной локализации бактерий P. putida с помощью флюоресцентной микроскопии

Рисунки 3, 4 - Корень растений томатов, предварительно обработанных суспензией бактерий P.putida В-28 (3) и P.putida КТ (4) и помещённый на газированную питательную среду в чашку Петри 3 4

Рисунки 5, 6, 7 - Корневые волоски растений томатов, обработанные суспензией бактерий P.putida KT (5), P.putida B-28 (6), P.putida B-37(7). Объектив A-Plan 10x/0,45, Filter Set 02 Клетки бактерий 5 7 6

89 Рисунки 8, 9 – Клетки корня растений томатов, обработанных суспензией бактерий P.putida B-28 (8), P.putida B-37 (9). Объектив A-Plan 20x/0,45, Filter Set 02

Клетки бактерий Рисунки 10, 11 - Клетки корня растений томатов, обработанных суспензией бактерий P.putida B-37. Объектив A-Plan 40x/0,45, Filter Set 02 спустя 3 секунды начальный момент времени 10101

Скрининг коллекции ризосферных бактерий P. putida на наличие гена acdS На следующем этапе работы был проведен ПЦР скрининг коллекции ризосферных бактерий рода P. putida на наличие гена acdS, кодирующего синтез АЦК - дезаминазы. Таблица 1 - Скрининг штаммов бактерий P.putida на наличие acdS- гена штамма Название штамма Наличие ПЦР-продукта ожидаемого размера (1000 п.н.) 1 P. putida B - 27 _ 2 P. putida B P. putida B P. putida M + 5 P. putida KT_

1000 п.н Рисунок 12 - Электрофоретический анализ продуктов ПЦР бактерий 1 - P. putida B-27, 2 - P. putida KT, 3 - P. putida B-37, 4 - P. putida М, 5 - P. putida B-28.

Клонирование acdS- гена бактерий P. putida B-37 в клетках E. coli Xl-1 blue и P. putida B-37 Следующим этапом нашей работы являлось клонирование гена acdS бактерий P. putida B-37 в клетках E. coli Xl-1 blue. Для амплификации гена acdS использовалась полимеразная цепная реакция ( ПЦР ). В качестве ДНК - матрицы использовалась хромосомная ДНК бактерий P. putida B-37. Амплификацию acdS- гена проводили применяя праймеры и программу, описанные в предыдущем разделе.

Лигирование с T- вектором Лигирование с T- вектором Рисунок 14 - Схема Т – вектора (pTZ57R/T из набора InsTAclone TM PCR Cloning Kit производства «Fermentas») Рисунок 13 - Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 0,7% агарозном геле 1000 п.н.

Рестрикция рекомбинантной плазмидной ДНК п.н п.н п.н. Указаны фрагменты размером 3000 п.н., что соответствует размеру T-вектора без вставки и фрагмент размером 4000 п.н., что соответствует Т-вектору со вставкой фрагмента Фрагмент 3000 п.н., соответствующий линейному размеру Т-вектора; фрагмент 1000 п.н., соответствующий фрагменту, несущему acdS-ген P. putida B-37

Рисунок 17 - Рестрикционная карта плазмиды pTKAСCL7 Рисунок 18 - Электрофоретический анализ продуктов ПЦР 1000 п.н.

BamHI EcoRI BamHI EcoRI лигирование отбор на Sm R pРВ п.н. Рисунок 19 - Схема пере клонирования фрагмента, несущего acdS-ген из плазмиды pTKAСCL7 в вектор широкого круга хозяев pAYS31

Рисунок 20 - Рестрикционный анализ рекомбинантной плазмидной ДНК Фрагмент п.н., соответствующий линейному размеру вектора pAYS31; фрагмент 1000 п.н., соответствующий фрагменту, несущему acdS-ген P. putida B п.н п.н. Проверка наличия плазмиды p РВ 37 в клетках E. coli Xl-1 blue.

Изучение экспрессии acdS- гена в гомо - и гетерологичной системах ( клетках P. putida B-37 и E.coli XL-1 blue) Для изучения экспрессии acdS- гена бактерий Р. putida B-37 в гомологичной системе необходимо было осуществить перенос плазмиды p РВ 37 в клетки Р. putida B-37. Данная плазмида была выделена из бактерий E. coli Xl-1 blue и перенесена путем трансформации в клетки Р. putida B-37. Отбор трансформантов осуществляли на селективной среде, содержащей антибиотик стрептомицин в концентрации 50 мкг / мл. В ходе эксперимента были получены стрептомицин - резистентные клоны бактерий Р. putida B-37. Следующим этапом работы явилось изучение экспрессии клонированного гена в гомологичной (P. putida B-37) и гетерологичной (E. coli Х l-1 blue) системах. Изучение экспрессии acdS- гена проводили путем измерения активности фермента АЦК - дезаминазы, кодируемого данным геном, при помощи методики, предложенной M. Honma, T. Shimomura в 1978.

Штамм бактерий Удельная активность, нмоль/мг белка*мин Относительн ая активность, % P. putida B-37 8,5±0,2 100,0 P. putida B-37/ pPB37 15,5±0,2 182,4 E. coli Xl-1 blue /pPB37 4,0±0,1 47,0 E. coli Xl-1 blue00 Активность АЦК - дезаминазы у изучаемых бактерий

выводы 1. Была установлена ризосферная локализация бактерий P. putida с помощью флюоресцентной микроскопии. 2. С помощью ПЦР был проведён скрининг коллекции ризосферных бактерий P. putida и выявлено наличие acdS- гена у трёх штаммов бактерий : P. putida В -28, P. putida В -37 и P. putida М. 3. Ген acdS бактерий P. putida B-37 был клонирован в клетках E. coli Xl-1 blue в составе Т - вектора. 4. Ген acdS бактерий P. putida B-37 был клонирован в составе вектора широкого круга хозяев. 5. Была определена экспрессия acdS- гена бактерий P. putida B-37 в гомо - и гетерологичной системах и показано, что клонированный acdS- ген в гомологичной системе экспрессируется нормально ( почти в 2 раза выше, чем у бактерий дикого типа ), а в гетерологичной системе E. coli Xl-1 blue осуществляется с низкой эффективностью (47,0% от активности в штамме P. putida).

Спасибо за внимание ! Электронный адрес :