ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У МУТАНТНЫХ И ГЕННО- ИНЖЕНЕРНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ФЕНАЗИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ. Магистерская диссертация Шиловой Ю.А Научный руководитель к. б. н., старший преподаватель Веремеенко Е. Г. БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

изучение удельной активности СОД у штаммов В-162, В-162/255 и штаммов на их основе. исследование удельной активности каталазы у полученных и исходных штаммов. клонирование генов phzIR в составе вектора в клетках штаммов B-162 и В-162/255 ПЦР-идентификация phzIR-локуса в клетках P. aurantiaca B-162. Целью данной работы являлось получение с помощью генно- инженерных методов высокоэффективных штаммов-продуцентов феназиновых антибиотиков и исследование у них активности антиоксидантной системы. секвенирование клонированного фрагмента.

Объект исследований В качестве объектов исследования использовали штамм P. aurantiaca B 162, из коллекции кафедры генетики Белорусского государственного университета (коллекционный номер ВКМВ- 162), полученные на его основе мутантные штаммы, способные к сверх продукции феназинов: В-162/255 и В-162/17.

Характеристика биосинтеза феназиновых антибиотиков

Регуляция биосинтеза феназиновых антибиотиков На уровне транскрипции: σ-факторы QS-система На посттранскрипционном уровне: Двухкомпонентные системы Двухкомпонентные системы

QS-система Регуляция на уровне транскрипции Одним из механизмов, с помощью которых бактерии регулируют продукцию феназинов, является регуляция экспрессии генов, зависящая от плотности популяции бактерии или регуляции с помощью QS-системы. Системы QS включают два обязательных компонента: низкомолекулярные сигнальные молекулы – ауто индукторы и регуляторные белки, с которыми связываются ауто индукторы. Рисунок 1 – QS-зависимая регуляция продукции феназинов у P. chlororaphis PCL1391 [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ПЦР-продукты phzIR- участка для: 1 – P. aurofaciens (контроль), 2 – P. aurantiaca B-162; М – маркер молекулярных масс фрагментов ДНК GeneRuler 1kb DNA Ladder #SM0311 Рисунок 1 – Электрофоретический анализ продуктов амплификации phzIR-участка ПЦР-идентификация генов, осуществляющих положительную регуляцию синтеза феназинов у бактерий P. aurantiaca

Клонирование phzIR-участка Клонирование phzIR-участка 1 – ПЦР-продукт phzIR-генов (контроль), 2 – линеаризированная по SmaI форма ДНК плазмиды pTZ57R/T, 3 – кольцевая форма ДНК плазмиды pTZ57R/T, 4 – ПЦР-продукт плазмиды со вставкой, М – маркер молекулярных масс фрагментов ДНК GeneRuler 1kb DNA Ladder #SM0311 Рисунок 3 – Электрофоретический анализ рекомбинантной плазмиды pTZ57R/T со вставкой phzIR- фрагмента

Рисунок 4 – Электорофоретический анализ рекомбинантной плазмиды pAYC31phzIR а – ПЦР-продукты: 1 – плазмиды pAYC31 без вставки (контроль), 2 – плазмиды со вставкой phzIR- генов, 3 – хромосомных генов phzIR P. aurantiaca (контроль), б – ДНК плазмиды pAYC31phzIR: 1 – кольцевая форма, 2 – линеаризированная BamHI-форма; М – маркер молекулярных масс фрагментов ДНК GeneRuler 1kb DNA Ladder #SM0311 аб Клонирование phzIR-участка 1000 п.н М М 1 2

Штаммы N-гексаноил-гомосерин лактон (ОП 585 ) В-162 (дикий тип)0,1016±0,0089 В-162 (pAYC31phzIR)0,1894±0,0118 В-162/2550,1828±0,0417 В-162/255 (pAYC31phzIR)0,2748±0,0137 В-162/170,1187±0,0291 В-162/17 (pAYC31phzIR)0,1483±0,0215 Уровень образования гексаноил-гомосерин лактона плазмид содержащими бактериями P. aurantiaca (pAYC31phzIR)

Продукция феназиновых антибиотиков плазмид содержащими бактериями P. aurantiaca (pAYC31phzIR) Штаммы Феназины (мг/л) В-162 (дикий тип)75±8,95 В-162 (pAYC31phzIR)410±25,83 В-162/255420±30,11 В-162/255 (pAYC31phzIR)500±29,78 В-162/17220±14,62 В-162/17 (pAYC31phzIR)300±17,84

В составе вектора pAYC31 осуществлено клонирование ПЦР-продукта участка хромосомы бактерий P. aurantiaca, размером 1735 п.н., содержащего гены phzIR. Установлено, что введение phzIR-генов в клетки указанных штаммов повышает у них уровень синтеза ГГЛ в 1,3-1,9 раза, а феназинов в 1,2-5,5 раза. Повышенный уровень продукции феназиновых антибиотиков коррелирует с увеличением уровня удельной активности каталазы (в 17 раз для штамма В-162(pAYC31phzIR) и в 2 – для штамма В-162/255(pAYC31phzIR)). Удельная активность СОД подвержена ингибированию в присутствии высоких концентраций феназинов. Заключение

Спасибо за внимание !