Wet Lab Смирнов Арсений Пензенцева Евгения

2

ДНК (4 нуклеотида: А, Т, G, C) 3

Выделение ДНК 4

5

Оценка качества и количества ДНК Электрофорез Спектрофотометрия Флуорометрия элетрофорез спектрофотометрия С[µg/ml] = А 260 x K K (dsDNA) = 50 K (ssDNA) = 37 K (ssRNA) = 40 А 260 /А 280 = 1,8-1,9 – чистая ДНК 6

Электрофорез 7

Плазмиды 8 Состав вектора: Ориджин репликации Селективный маркёр Полилинкер

pBluescript II SK (+) 9

Севенирование ДНК - прочтение последовательности Классические методы: Максам-Гилберт (химическое) Сэнгер (энзиматическое) 10

Секвенирование (Сэнгер) 11

Автоматическое секвенирование 12

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 1983 г, Кэри Муллис – метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количества определённых фрагментов ДНК «Полимеразная» - используется фермент ДНК- полимераза «Цепная» - состоит из повторяющихся циклов, количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии 13

Компоненты ПЦР ПраймерыОпределяют амплифицируемый участок dNTP«Строительный материал» KCl Моновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров TrisПоддержание оптимального для ферментативной реакции рН MgCl 2 Бивалентный катион необходим для работы фермента ПолимеразаОсуществляет синтез ДНК МатрицаАнализируемый образец ДНК Буфер 14

Суть ПЦР 15

Этапы ПЦР Предварительная денатурация ~95 0 C1-10 мин циклов Денатурация~95 0 C10-60 сек Отжиг C10-60 сек Элонгация C сек Финальная элонгация C7-10 мин 16

Амплификаторы Термостатирование: твёрдый термоблок (элемент Пельтье) жидкость поток воздуха 17

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) одновременная амплификация и измерение количества продукта наличие флюоресцентного красителя в смеси наличие оптического блока в амплификаторе линейныйlg 18

Системы детекции 1.Неспецифичные – интеркалирующие красители (SYBR Green и др.) 2.Специфичные – линейные разрушаемые пробы (TaqMan) – «молекулярные маячки» (beacons) – примыкающие пробы 19

Линейные разрушаемые пробы (TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man) 20

21 Непрямые антикоагулянты: варфарин аценокумарол фенпрокумон кумарин Фармакогенетика препаратов для лечения тромбозов

22 Заболевания, при которых назначают непрямые антикоагулянты: Венозные тромбозы Легочная тромбоэмболия Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией и трансплантацией сердечных клапанов Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокарда и случаев тромбоэмболических осложнений

23 Нежелательные лекарственные реакции (НЛР) – кровотечения. МНО (международное нормализованное отношение). При применении варфарина частота кровотечений достигает 25%. Факторы риска кровотечений при применении непрямых антикоагулянтов: Сопутствующие заболевания Применение других препаратов Нарушение дозировки Индивидуальная чувствительность Непрямые антикоагулянты – антагонисты витамина К 1

24 Метаболизм витамина К 1 (factor II, VII, IX, X, protein C, S, Z)

25 Полиморфизм гена CYP2C9 Аллельные варианты гена: – CYP2C9*1 – нормальная каталитическая активность – CYP2C9*2 (Arg144Cys) - пониженная каталитическая активность – CYP2C9*3 (Ile359Leu) – выраженная пониженная каталитическая активность ATT 1075 Exon 3 Exon 7 CGT 430 Arg Ile Exon 3 Exon 7 TGTATT Cys Ile Exon 3 Exon 7 CGTCTT Arg Leu

26 Снижение дозы варфарина в зависимости от генотипа CYP2C9 (Lindh et al.,2009) Частоты аллелей в европейской популяции: CYP2C9*2 – 10%, CYP2C9*3 – 6%