РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Институт биологии Кафедра ботаники, биотехнологии и ландшафтной архитектуры Методы и проблемы криоконсервации растений и микроорганизмов Тюмень, 2015 г.

В плане молекулярно-генетических исследований предусматривается создание коллекций маркированного генетического материала наиболее ценной части генофонда культурных растений и их диких сородичей (прежде всего исчезающих видов) на основе консервации ДНК.

Криосохранение – это глубокое замораживание и хранение клеток, тканей и органов растений при сверхнизкой температуре (-196°С). На небольшой лабораторной площади может депонироваться значительное количество образцов гермоплазмы. Методы и проблемы криоконсервации растений

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов: - вид и тип клеток, - их концентрация в суспензии, - состав среды для консервирования, - вид и концентрация криопротектора, - режим охлаждения и отогрева, - способ реабилитации клеток после отогрева.

В настоящее время процедуры криосохранения разработаны для более чем 100 видов растений. В настоящее время разработаны несколько эффективных способов криоконсервации растительных тканей in vitro: метод инкапсуляции- дегидратации, метод витрификации, метод медленного программного замораживания.

1 ) Метод медленного замораживания заключается в постепенном охлаждении растительных тканей в программируемом замораживателе (фризере) до - 40°С. После достижения этой температуры ткани переносят в жидкий азот (- 196°С). Рис. Программный замораживатель Рис. Хранение биоматериала в жидком азоте

2) Метод инкапсуляции-дегидратации основан на технологии, используемой для получения искусственных семян. Апикальные меристемы заключают в альгинатный гель, что позволяет обезвоживать и подсушивать ткани, тем самым предотвращается образование кристаллов льда внутри клеток. После частичной дегидратации инкапсулированные в альгинат апикальные меристемы помещают в криопробирки и быстро погружают в жидкий азот.

3) Метод витрификации. При использовании метода витрификации растительный материал обрабатывают высококонцентрированными растворами криопротекторов и быстро погружают в жидкий азот. В результате витрификации происходит затвердевание воды в аморфном состоянии, что предотвращает образование внутриклеточных кристаллов льда.

В большинстве методик криосохранения особенно важным этапом является предварительная обработка растительных тканей. Она может включать: химическую обработку с использованием осмотических или проникающих криопротекторов, холодовую акклиматизацию пробирочных растений, обработку высушиванием в потоке воздуха или с использованием высушивающих веществ.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты. В среду добавляют различные вещества, например: 2-6% маннит или сорбит; аминокислоты, в первую очередь пролин; диметилсульфоксид (ДМСО); кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя. Рис. Размораживание клеток в оттаивателе

Рис. Замораживание клеток: а) быстрое, б) медленное, поэтапное

Факторы, влияющие на жизнеспособность клеток после криосохранения. Физиологическое состояние культивируемых меристем, клеток, протопластов и т.д. в значительной степени определяет успех программы по их длительному сохранению при криогенных температурах. Изолированных меристемы растений, которые в природе устойчивы к низким температурам, имеют более высокую выживаемость после размораживания, чем клетки, находящиеся в разных фазах митотического цикла. Клетки после митотического деления более устойчивы к замораживанию, чем клетки, находящиеся в разных фазах митотического цикла. Благоприятный эффект оказывает предварительная обработка тканей и клеток осмотически активными веществами, такими, как маннитол и сорбитол (в концентрации от 3 до 6%), которые уменьшают объем и водный потенциал клеток.

Методы и проблемы криоконсервации микроорганизмов Весьма богатый опыт работы с коллекциями свидетельствует о том, что ряд современных методов консервации оказывается относительно эффективным при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов представляет собой проблему, особенно если учесть необычайное физиологическое разнообразие микроорганизмов, а также то, что способность сохранять жизнеспособность в определенных условиях оказывается связана не только с родом и видом микроорганизма, но нередко с его расой.

Методы длительного хранения микроорганизмов Длительное хранение клеток без утраты ценных свойств проводится методами, обеспечивающими существенное торможение протекающих у них жизненных процессов. Это достигается путем глубокого замораживания микроорганизмов или их высушивания из замороженного (лиофилизация) либо непосредственно из жидкого состояния (L- высушивание).

Консервация замораживанием при низких температурах. Практически все известные группы бактерий способны длительно храниться в замороженном состоянии при низких (криогенных) температурах (температуры ниже 120 К, т.е. менее минус 153 °С).